p21CDKN1A is a cyclin-dependent kinase inhibitor playing multiple roles such as cell cycle arrest, transcription regulation, apoptosis, and cell motility. An important function of p21 in the DNA damage response is, however, mediated by the interaction with Proliferative Cell Nuclear Antigen (PCNA), an essential factor required in DNA replication and repair. Yet, the role in DNA repair is still debated, even if several studies have demonstrated that p21 does not inhibit DNA repair, and instead it might have a regulatory role in this process. In fact, previous findings demonstrated a role of p21 in nucleotide excision repair (NER), by regulating the interaction between PCNA and p300, thereby removing the inhibition of p300 activity. In addition, p21 was found to influence the interaction between XPG and p300, further suggesting a regulatory function mediated through PCNA binding. Since it was previously observed that p21 may interact with DNA polymerase δ (DNA pol δ) after UV damage, we have investigated whether p21 may interact with this protein, and whether p21 accumulation at UV damage sites might influence the recruitment of other PCNA partners involved in NER. The results have shown that: after UVC p21 accumulates at the UV damage sites in concomitance with PCNA and DNA pol δ and other NER factors. CUL4A, an E3 ubiquitin ligase, silencing induced persistent levels of p21 protein at local DNA damage sites. The results suggested that accumulation of p21 protein at DNA damage sites, consequent to inhibition of its degradation, did not block the recruitment of NER factors interacting with PCNA. These findings were also confirmed by live cell imaging experiments using fluorescent fusion proteins of p21, PCNA and DNA pol δ. All these data suggest that p21 accumulation does not inhibit neither DNA pol δ accumulation, nor recruitment of other PCNA interacting proteins, and further delineate a picture in which p21 actively participates in NER, before its degradation, in order to coordinate in time and space, the interaction of PCNA with its multiple partners.
p21CDKN1A è un inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti ed ha numerosi ruoli come ad esempio arresto del ciclo cellulare, regolazione della trascrizione, apoptosi e motilità cellulare. L'interazione con PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) è determinante nel mediare il suo ruolo nella risposta a danno al DNA. Tuttavia il ruolo di p21 nel DNA repair è ancora dibattuto, nonostante numerosi studi abbiano dimostrato che p21 non inibisce la riparazione del DNA, ma potrebbe avere un ruolo regolativo nel processo. Infatti, dati preliminari hanno dimostrato un ruolo di p21 nel processo di nucleotide excision repair (NER) regolando l'interazione tra PCNA e p300, in particolare rimuovendo l'inibizione dell'attività di p300. Inoltre p21 influenza l'interazione tra XPG e p300, suggerendo ulteriormente un ruolo regolativo in seguito al legame con PCNA. La sua interazione con la DNA polimerasi δ dopo danno da UV è già stata documentata, per questo abbiamo investigato se p21, e il suo accumulo ai siti di danno da UV sul DNA, possano influenzare il reclutamento dei partner di PCNA coinvolti nel NER. I risultati hanno dimostrato che: in seguito a danno da UV p21 si accumula ai siti di danno insieme a PCNA e la DNA polimerase δ ed altri fattori NER. Il silenziamento del CUL4A, un E3 ubiquitina ligasi, induce persistenti livelli di p21 ai siti di danno. I risultati suggeriscono che l'accumulo di p21 ai siti di danno sul DNA, in seguito ad inibizione della sua degradazione, non blocca il reclutamento dei fattori NER che interagiscono con PCNA. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati tramite tecniche di live cell imaging utilizzando proteine fluorescenti di fusione di p21, PCNA e DNA pol δ. Concludendo questi dati suggeriscono che l'accumulo di p21 non inibisce né il reclutamento di DNA pol δ, né di altre proteine interagenti con PCNA. Inoltre delineano un modello in cui p21 potrebbe attivamente partecipare al processo di NER prima della sua degradazione per coordinare nello spazio e nel tempo le interazioni di PCNA con i suoi molteplici partner.
Influenza della proteina p21(CDKN1A) sul reclutamento dei fattori di riparazione del DNA ai siti di danno.
MAFFIA, ANTONIO
2014/2015
Abstract
p21CDKN1A is a cyclin-dependent kinase inhibitor playing multiple roles such as cell cycle arrest, transcription regulation, apoptosis, and cell motility. An important function of p21 in the DNA damage response is, however, mediated by the interaction with Proliferative Cell Nuclear Antigen (PCNA), an essential factor required in DNA replication and repair. Yet, the role in DNA repair is still debated, even if several studies have demonstrated that p21 does not inhibit DNA repair, and instead it might have a regulatory role in this process. In fact, previous findings demonstrated a role of p21 in nucleotide excision repair (NER), by regulating the interaction between PCNA and p300, thereby removing the inhibition of p300 activity. In addition, p21 was found to influence the interaction between XPG and p300, further suggesting a regulatory function mediated through PCNA binding. Since it was previously observed that p21 may interact with DNA polymerase δ (DNA pol δ) after UV damage, we have investigated whether p21 may interact with this protein, and whether p21 accumulation at UV damage sites might influence the recruitment of other PCNA partners involved in NER. The results have shown that: after UVC p21 accumulates at the UV damage sites in concomitance with PCNA and DNA pol δ and other NER factors. CUL4A, an E3 ubiquitin ligase, silencing induced persistent levels of p21 protein at local DNA damage sites. The results suggested that accumulation of p21 protein at DNA damage sites, consequent to inhibition of its degradation, did not block the recruitment of NER factors interacting with PCNA. These findings were also confirmed by live cell imaging experiments using fluorescent fusion proteins of p21, PCNA and DNA pol δ. All these data suggest that p21 accumulation does not inhibit neither DNA pol δ accumulation, nor recruitment of other PCNA interacting proteins, and further delineate a picture in which p21 actively participates in NER, before its degradation, in order to coordinate in time and space, the interaction of PCNA with its multiple partners.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/21700