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Angelman Syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disorder caused by the loss of function of the maternally inherited UBE3A allele, characterized by severe cognitive and motor impairments. The goal of this study was to characterize the synaptic dysfunction in an AS model mice with a deletion mutation of maternal Exon 2 of UBE3A. We evaluated: the mechanisms underlying this disease, phenotypic differences related to sex and the correlation between the animals’ age and the progression of the disease. Once we characterized the synaptic damage in this model and proved that the c-Jun N-terminal kinase (JNK) plays a key role in this pathology, we tested the neuroprotective effect of the cell permeable peptide D-JNKI1, a JNK inhibitor, in counteracting this synaptic alterations. First, we analyzed the AS animals’ metabolic profile and determined that het+/- males progressively gain more weight compared to their wt littermates, while het+/- females progressively weight less compared to wt females. Then we decided to evaluate the cognitive and motor impairment of the AS mice through different behavioral tests (NORT, OFT, Rotarod), starting at 7 weeks of age and every 4 weeks up to 23 weeks of age. AS mice performed worse compared to their wt littermates throughout the experimental window. In particular, het+/- females performed worse in the NORT compared to het+/- males. Since the UBE3A gene is involved in synaptic connectivity and since JNK plays a key role in synaptic dysfunction we analyzed the JNK pathway both in the cell soma and in the dendritic spine using samples from the animals’ cerebral cortex, hippocampus and cerebellum. We detected a moderate JNK activation in 7 weeks old AS mice, and an hyperactivation of the JNK pathway in 23 weeks old AS mice. We also assessed the dendritic spine’s post-synaptic markers levels, such as PSD95, Drebrin and Shank3: in 7 weeks old AS mice there’s an increase in the phosphorilation levels of PSD95, a Shank3 increase and a Drebrin reduction, while in 23 weeks old AS mice there’s a even more noticeable imbalance of these post-synaptic markers. Subsequently, we tested the cell-permeable peptide D-JNKI1 on the AS mouse model. The treatment was administered starting at 7 weeks of age and every 4 weeks up to 23 weeks of age. Following the treatment, the AS animals’ growth curves show a recovery of normal body weight both for het+/- males and females. Furthermore, the treatment determined a significant recovery of the AS mice cognitive performance, which was more pronounced in het+/- females. The motor and exploratory performance of the AS mice were also analyzed, and showed a recovery of the motor performance in the treated mice, especially in males, while in females there is an initial recovery of motor activity that normalizes from 15 weeks of age up to the advanced stage of the disease. We evaluated the treatment effect on the JNK activity and the synaptic damage, using samples from 23 weeks old AS mice. D-JNKI1 promotes the recovery of the JNK signaling at a baseline activity both in the cell soma and in the dendritic spine in cortex, hippocampus and cerebellum, and the levels of post-synaptic markers are normalized as well. In conclusion, we state that the AS mouse model used in this study is a model to study synaptopathy in which JNK plays key role in the synaptic dysfunction. We also demonstrated how the treatment using the peptide D-JNKI1 has a neuroprotective effect and promotes the recovery of the cognitive and motor performance.

La Sindrome di Angelman (AS) é una malattia genetica rara del neurosviluppo causata dalla perdita dell’allele materno del gene UBE3A (Ubiquitin ligase E3A), caratterizzata da gravi disfunzioni sia cognitive che locomotorie. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di caratterizzare la disfunzione sinaptica nel modello murino di AS deleto dell’allele materno a livello dell’esone 2, analizzando: i meccanismi alla base di questa patologia, eventuali differenze fenotipiche legate al sesso e la correlazione tempo-progressione della malattia. Una volta caratterizzato il danno sinaptico, evidenziando il ruolo chiave della chinasi JNK in questo meccanismo patologico, abbiamo testato il potenziale effetto neuroprotettivo del peptide cellula permeabile D-JNKI1, inibitore della chinasi JNK, nel contrastare tale alterazione sinaptica. Abbiamo quindi analizzato il profilo metabolico degli animali AS, evidenziando un incremento del peso corporeo nei maschi het+/- rispetto agli animali wt progressivo nel tempo e, al contrario, una riduzione del peso corporeo nelle femmine het+/- rispetto ai wt. Abbiamo poi esaminato i deficit cognitivi e locomotori associati ai topi AS tramite test comportamentali (NORT, OFT, Rotarod) a 7 settimane d’età ed ogni 4 settimane fino alle 23 settimane d’età, riscontrando una riduzione delle performance dei topi het+/- rispetto ai wt progressiva nel tempo, evidenziando un deficit cognitivo più severo nelle femmine rispetto ai maschi het+/-. Essendo UBE3A un gene coinvolto nella connettività sinaptica e, avendo dimostrato nel nostro laboratorio il ruolo chiave di JNK nella disfunzione sinaptica, abbiamo analizzando il pathway di JNK sia nel soma che nella spina dendritica in corteccia, ippocampo e cervelletto di topi AS a 7 e 23 settimane di età. È stata riscontrata una moderata attivazione di JNK a 7 settimane d’età e un’iperattivazione di JNK a 23 settimane d’età. A livello della spina dendritica abbiamo anche analizzato i livelli di determinati marker post-sinaptici, rilevando a 7 settimane d’età un moderato aumento della fosforilazione di PSD95 e dei livelli di Shank3 e una riduzione dei livelli di Drebrin, e a 23 settimane d’età alterazioni dei marker post-sinaptici ancora più marcate. Successivamente abbiamo deciso di somministrare in cronico il peptide cellula permeabile D-JNKI1 nel modello murino di AS, a partire dalle 7 settimane d’età ed ogni 4 settimane fino alle 23 settimane d’età. In seguito al trattamento, la valutazione delle curve di crescita ha evidenziato un recupero del normale peso corporeo sia nei maschi che nelle femmine het+/- trattati. La somministrazione del peptide D-JNKI1 ha inoltre determinato un recupero significativo delle performance cognitive negli animali het+/- trattati rispetto agli het+/- non trattati, in particolare nelle femmine het+/-. Analizzando le performance motorie ed esploratorie mediante Rotarod ed Open Field test, abbiamo osservato un recupero dai deficit locomotori negli animali het+/- trattati, in particolar modo nei maschi, mentre nelle femmine si osserva un iniziale recupero dell’attività locomotoria che si normalizza dalle 15 settimane di età fino allo stadio avanzato della patologia. Infine, abbiamo valutato l’effetto del trattamento sull’attività di JNK e sul danno sinaptico a 23 settimane d’età, riscontrando come esso abbia riportato a livelli basali l’attivazione del JNK signaling sia a livello del soma che della spina dendritica in corteccia, ippocampo e cervelletto, e come anche i livelli dei marker post-sinaptici vengano normalizzati. In conclusione, possiamo affermare come il modello murino utilizzato sia un modello di sinaptopatia in cui la chinasi JNK svolge un ruolo chiave nella disfunzione sinaptica e come il trattamento in cronico con il peptide D-JNKI1 abbia un effetto neuroprotettivo e promuova un recupero delle capacità cognitive e motorie.

Il ruolo della JNK chinasi nella sindrome di Angelman: utilizzo dell’inibitore cellula permeabile di JNK come strategia terapeutica

AGRÒ, GRAZIELLA
2017/2018

Abstract

Angelman Syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disorder caused by the loss of function of the maternally inherited UBE3A allele, characterized by severe cognitive and motor impairments. The goal of this study was to characterize the synaptic dysfunction in an AS model mice with a deletion mutation of maternal Exon 2 of UBE3A. We evaluated: the mechanisms underlying this disease, phenotypic differences related to sex and the correlation between the animals’ age and the progression of the disease. Once we characterized the synaptic damage in this model and proved that the c-Jun N-terminal kinase (JNK) plays a key role in this pathology, we tested the neuroprotective effect of the cell permeable peptide D-JNKI1, a JNK inhibitor, in counteracting this synaptic alterations. First, we analyzed the AS animals’ metabolic profile and determined that het+/- males progressively gain more weight compared to their wt littermates, while het+/- females progressively weight less compared to wt females. Then we decided to evaluate the cognitive and motor impairment of the AS mice through different behavioral tests (NORT, OFT, Rotarod), starting at 7 weeks of age and every 4 weeks up to 23 weeks of age. AS mice performed worse compared to their wt littermates throughout the experimental window. In particular, het+/- females performed worse in the NORT compared to het+/- males. Since the UBE3A gene is involved in synaptic connectivity and since JNK plays a key role in synaptic dysfunction we analyzed the JNK pathway both in the cell soma and in the dendritic spine using samples from the animals’ cerebral cortex, hippocampus and cerebellum. We detected a moderate JNK activation in 7 weeks old AS mice, and an hyperactivation of the JNK pathway in 23 weeks old AS mice. We also assessed the dendritic spine’s post-synaptic markers levels, such as PSD95, Drebrin and Shank3: in 7 weeks old AS mice there’s an increase in the phosphorilation levels of PSD95, a Shank3 increase and a Drebrin reduction, while in 23 weeks old AS mice there’s a even more noticeable imbalance of these post-synaptic markers. Subsequently, we tested the cell-permeable peptide D-JNKI1 on the AS mouse model. The treatment was administered starting at 7 weeks of age and every 4 weeks up to 23 weeks of age. Following the treatment, the AS animals’ growth curves show a recovery of normal body weight both for het+/- males and females. Furthermore, the treatment determined a significant recovery of the AS mice cognitive performance, which was more pronounced in het+/- females. The motor and exploratory performance of the AS mice were also analyzed, and showed a recovery of the motor performance in the treated mice, especially in males, while in females there is an initial recovery of motor activity that normalizes from 15 weeks of age up to the advanced stage of the disease. We evaluated the treatment effect on the JNK activity and the synaptic damage, using samples from 23 weeks old AS mice. D-JNKI1 promotes the recovery of the JNK signaling at a baseline activity both in the cell soma and in the dendritic spine in cortex, hippocampus and cerebellum, and the levels of post-synaptic markers are normalized as well. In conclusion, we state that the AS mouse model used in this study is a model to study synaptopathy in which JNK plays key role in the synaptic dysfunction. We also demonstrated how the treatment using the peptide D-JNKI1 has a neuroprotective effect and promotes the recovery of the cognitive and motor performance.
NEUROBIOLOGIA [08413]
2017
JNK role in Angelman Syndrome: using a cell permeable JNK inhibitor as a therapeutic strategy
La Sindrome di Angelman (AS) é una malattia genetica rara del neurosviluppo causata dalla perdita dell’allele materno del gene UBE3A (Ubiquitin ligase E3A), caratterizzata da gravi disfunzioni sia cognitive che locomotorie. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di caratterizzare la disfunzione sinaptica nel modello murino di AS deleto dell’allele materno a livello dell’esone 2, analizzando: i meccanismi alla base di questa patologia, eventuali differenze fenotipiche legate al sesso e la correlazione tempo-progressione della malattia. Una volta caratterizzato il danno sinaptico, evidenziando il ruolo chiave della chinasi JNK in questo meccanismo patologico, abbiamo testato il potenziale effetto neuroprotettivo del peptide cellula permeabile D-JNKI1, inibitore della chinasi JNK, nel contrastare tale alterazione sinaptica. Abbiamo quindi analizzato il profilo metabolico degli animali AS, evidenziando un incremento del peso corporeo nei maschi het+/- rispetto agli animali wt progressivo nel tempo e, al contrario, una riduzione del peso corporeo nelle femmine het+/- rispetto ai wt. Abbiamo poi esaminato i deficit cognitivi e locomotori associati ai topi AS tramite test comportamentali (NORT, OFT, Rotarod) a 7 settimane d’età ed ogni 4 settimane fino alle 23 settimane d’età, riscontrando una riduzione delle performance dei topi het+/- rispetto ai wt progressiva nel tempo, evidenziando un deficit cognitivo più severo nelle femmine rispetto ai maschi het+/-. Essendo UBE3A un gene coinvolto nella connettività sinaptica e, avendo dimostrato nel nostro laboratorio il ruolo chiave di JNK nella disfunzione sinaptica, abbiamo analizzando il pathway di JNK sia nel soma che nella spina dendritica in corteccia, ippocampo e cervelletto di topi AS a 7 e 23 settimane di età. È stata riscontrata una moderata attivazione di JNK a 7 settimane d’età e un’iperattivazione di JNK a 23 settimane d’età. A livello della spina dendritica abbiamo anche analizzato i livelli di determinati marker post-sinaptici, rilevando a 7 settimane d’età un moderato aumento della fosforilazione di PSD95 e dei livelli di Shank3 e una riduzione dei livelli di Drebrin, e a 23 settimane d’età alterazioni dei marker post-sinaptici ancora più marcate. Successivamente abbiamo deciso di somministrare in cronico il peptide cellula permeabile D-JNKI1 nel modello murino di AS, a partire dalle 7 settimane d’età ed ogni 4 settimane fino alle 23 settimane d’età. In seguito al trattamento, la valutazione delle curve di crescita ha evidenziato un recupero del normale peso corporeo sia nei maschi che nelle femmine het+/- trattati. La somministrazione del peptide D-JNKI1 ha inoltre determinato un recupero significativo delle performance cognitive negli animali het+/- trattati rispetto agli het+/- non trattati, in particolare nelle femmine het+/-. Analizzando le performance motorie ed esploratorie mediante Rotarod ed Open Field test, abbiamo osservato un recupero dai deficit locomotori negli animali het+/- trattati, in particolar modo nei maschi, mentre nelle femmine si osserva un iniziale recupero dell’attività locomotoria che si normalizza dalle 15 settimane di età fino allo stadio avanzato della patologia. Infine, abbiamo valutato l’effetto del trattamento sull’attività di JNK e sul danno sinaptico a 23 settimane d’età, riscontrando come esso abbia riportato a livelli basali l’attivazione del JNK signaling sia a livello del soma che della spina dendritica in corteccia, ippocampo e cervelletto, e come anche i livelli dei marker post-sinaptici vengano normalizzati. In conclusione, possiamo affermare come il modello murino utilizzato sia un modello di sinaptopatia in cui la chinasi JNK svolge un ruolo chiave nella disfunzione sinaptica e come il trattamento in cronico con il peptide D-JNKI1 abbia un effetto neuroprotettivo e promuova un recupero delle capacità cognitive e motorie.
BORSELLO, TIZIANA
Lauree Magistrali
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/21919