Sviluppo e ottimizzazione di un sistema portatile automatizzato per la caratterizzazione di agenti patogeni utilizzabile direttamente sul campo

Aim of this thesis was to develop and optimize protocols for the automatic extraction of nucleic acids from plant tissue by the miniaturized extractor developed by ST called “EASy”. One of the aim was to detect the precence of specific infectious agents through real-time PCR analysis. The final goal was to create a sustainable sample-to-answer flow with the use of Lab-on-a-chip technology developed by ST. The samples used for the extraction processes and the development of the specific assays were healthy and infected wheat seeds from the fungus Fusarium culmorum and stalks of Vitis Vinifera infected with the RNA GPgV virus. From standard manual extraction protocols new optimized ones have been created, which do not need heat steps or centrifugation. These improovements made nucleic acid extraction avaiable out of laboratory, and specific analyzes can be carried out directly in the field. Control extractions were performed, using EASy on one side and on the other side manual extractions were used as a reference. Subsequently, amplification and detection in real-time PCR of the samples extracted were carried out using the portable and miniaturized temocycler developed by ST called "Q3-PlusV2" (Q3). These tests gave the possibility to improve the protocols used on the Q3 device, bringing greater yield and efficiency. The results were compared with those obtained by Biorad CFX96, a bench-top thermal cycler used as gold standard. The union of these two steps, DNA extraction and qPCR, creates a sample-to-answer flow, a pivotal process in the molecular diagnostics field. It is increasingly necessary to perform these tests in the field, where there is a low availability of specialists and the conditions for the instruments use are often not optimal. The use of miniaturized and automated Lab-on-a-Chip (LoC) systems allows you to transport laboratory procedures on a miniaturized device. The development of a sample-to-answer flow foresees the pre-functionalization of the chip where the real-time PCR takes place. A lyophilisable PCR mix was produced to be inserted directly into the reaction chambers of the chip, in order to facilitate the passage of analysis to the final operator. In addition, the lyophilized cartridge allows transport and storage at room temperature, making it ideal for use in the field, for rapid interventions directly on the production chain.

Il presente lavoro di Tesi ha riguardato soprattutto lo studio, sviluppo e ottimizzazione di protocolli per l’estrazione automatica di acidi nucleici da tessuto vegetale tramite l’estrattore miniaturizzato sviluppato da ST (EASy); con annessa rilevazione di specifici agenti infettivi, se presenti, tramite analisi di real-time PCR. L’obbiettivo finale è la creazione di un flusso sample to answer sostenibile sul campo, con l’impiego della tecnologia Lab-on-a-chip sviluppata da ST. I campioni utilizzati per i processi di estrazione e lo sviluppo dei relativi saggi sono stati: semi di frumento sani e infetti dal fungo Fusarium culmorum, e piccioli di Vitis Vinifera infetti dal virus a RNA GPgV. A partire dai protocolli di estrazione standard effettuati in manuale, sono stati creati nuovi protocolli ottimizzati, che non prevedono passaggi al calore né di centrifugazione; eliminando quindi ogni tipo di strumentazione classica. Così facendo si rendono disponibili campioni di acidi nucleici su cui effettuare analisi specifiche direttamente sul campo. Sono state eseguite estrazioni di controllo, utilizzando da una parte EASy e dall’altra effettuando delle estrazioni in manuale come reference. Successivamente sono state svolte analisi di amplificazione e rilevazione in real-time PCR sui campioni estratti usando il temociclatore portatile e miniaturizzato sviluppato da ST denominato “Q3-PlusV2” (Q3). Questi test hanno permesso di migliorare i protocolli previsti per le analisi sul dispositivo Q3, apportando una maggior resa ed efficienza. I risultati sono stati paragonati con quelli ottenuti con lo strumento Biorad CFX96, un termociclatore da banco utilizzato come riferimento. L’unione di questi due passaggi, estrazione DNA e q-PCR, crea un flusso sample-to-answer, processo cardine nel campo della diagnostica molecolare. Sempre più spesso è necessario eseguire questi test sul campo, dove c’è una bassa disponibilità di specialisti e le condizioni per l’utilizzo delle strumentazioni spesso non sono ottimali. L’uso di sistemi “Lab-on-a-Chip” (LoC) miniaturizzati e automatizzati permette di trasportare le procedure di laboratorio su un dispositivo miniaturizzato. Lo sviluppo di un flusso sample-to-answer prevede anche la pre-funzionalizzazione del chip dove avviene la real-time PCR. È stata prodotta una mix per PCR liofilizzabile da inserire direttamente nelle camere di reazione del chip, in modo da facilitare il passaggio di analisi all’operatore finale. Inoltre la cartuccia liofila permette un trasporto ed una conservazione a temperatura ambiente, rendendola ideale all’utilizzo sul campo, per interventi rapidi direttamente sulla filiera produttiva