Studio comparativo degli effetti radiobiologici indotti a cellule esposte in adesione e in sospensione a BNCT, neutroni e raggi gamma

Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is a non conventional binary radiotherapy for cancer treatment based on thermal neutron irradiation of 10B pre-loaded tumour cells. The thermal neutron capture reaction on 10B, 10B(n,)7Li, give rise to high LET (Linear Energy Transfer) particles, that lose all their energy in a short range comparable to a cell diameter. The radiation lethality is therefore confined to neoplastic boron enriched cells while the surrounding healthy tissue is spared. This peculiarity makes BNCT a selective and effective therapeutic option in case of disseminated tumors that cannot be surgically removed nor treated with conventional radio-chemotherapy. The study object of this thesis is part of a wider in vitro research project addressed to preclinically validate the feasibility of liver, lung and osteosarcoma BNCT, towards the final clinical application. Extensive preclinical in vitro studies are mandatory to assess the dose related cell survival curve in order to prove the BNCT ability to kill large populations of tumor cells and to give information about its feasibility and dosimetry. The clonogenic assay is to date the more accepted techniques to evaluate cell survival after radiation treatments. The methodology provides that cells can be irradiated either in adherent or suspended conditions, although, to our knowledge, there is no prove that the modality of cell exposure is uninfluent on cell radiosensitivity. Main aim of this thesis is therefore to investigate whether the radio-sensitivity of adherent cell lines is affected by the modality of cell exposure to irradiation in order to optimize in vitro radiobiology experiments especially in the field of BNCT applied to cancer treatment. Cell survival and cell cycle perturbations have been extensively studied, respectively by clonogenic assay and flow cytometric DNA analysis, exposing the coloncarcinoma DHDK12TRb and the osteosarcoma UMR-106 cell lines, to different doses of Cobalt-60 γ-rays, neutrons and BNCT radiations. The two adherent growing cell lines were irradiated as adherent to the culture flask and as cell suspension after trypsin detachment in order to evaluate their radiosensivity differences. Dose related cell survival curves and cell cycle analyses evidenced the real existence of a different radiosensitivity between detached cells irradiated in suspension and those irradiated in the adherent configuration. The suspended ones are the more resistant and those with a marked block in the G2M cell cycle phase, that should reflect an higher repair capacity. Conversely to what proposed by the plating assay methodology, our results suggest that the modality of irradiation exposure influences the survival of adherent growing cell lines. Therefore this is an additional variable to be considered when comparing inter-intralaboratory results. Based on data obtained on the two analyzed cell lines, in order to optimize the exposure conditions for in vitro BNCT studies, the suggestion is that the adherent configuration should be preferred keeping cells in their natural environment and making it easier to reproduce the exposure condition obtaining comparable results.

La Terapia per Cattura Neutronica del Boro (BNCT) è una radioterapia non convenzionale di tipo binario per la cura del cancro basata sull’irraggiamento con neutroni termici di cellule neoplastiche precedentemente arricchite con 10B. La reazione di cattura dei neutroni termici da parte degli atomi di 10B, origina particelle ad alto LET (Linear Energy Transfer), che rilasciano tutta la loro energia dopo un breve tratto pari al diametro cellulare. I danni letali prodotti dalle radiazioni saranno pertanto limitati alle cellule neoplastiche arricchite in boro, risparmiando il tessuto sano circostante. Per questa sua peculiarità, la BNCT è una valida opzione terapeutica per la cura di tumori diffusi che non possono essere né aggrediti chirurgicamente né trattati con i convenzionali approcci radio-chemioterapeutici. Lo studio riportato nella presente tesi è parte di un più ampio progetto di ricerca in vitro volto a valutare la fattibilità della BNCT applicata alla cura di tumori epatici, polmonari e dell’ostosarcoma, prima di procedere all’applicazione clinica. Gli studi preclinici in vitro sono indispensabili al fine di ricavare la curva dose-sopravvivenza necessaria per verificare l’efficacia e la fattibilità della BNCT e per fornire informazioni in merito alla dosimetria. Il test di clonogenicità è al momento la tecnica ritenuta più idonea per la valutazione della sopravvivenza cellulare ai trattamenti radianti. La metodologia prevede che le cellule possano essere irraggiate indifferentemente in adesione o in sospensione, tuttavia, a nostra conoscenza, non esistono evidenze che la radiosensibilità della cellula non sia influenzata dalla sua modalità di esposizione alla radiazione. Il principale obiettivo di questa tesi è, quindi, quello di verificare l’influenza della modalità di esposizione sulla radiosensibilità cellulare alla scopo di ottimizzare gli studi radiobiologici in vitro specialmente per quanto attiene alla BNCT applicata al trattamento delle neoplasie. La sopravvivenza cellulare e le perturbazioni indotte al ciclo cellulare sono state ampiamente studiate, rispettivamente mediante il test di clonogenicità e l’analisi citofluorimetrica del DNA, trattando cellule delle linee di colon carcinoma DHDK12TRb e di osteosarcoma UMR-106 con differenti dosi di raggi gamma (60Co), neutroni e BNCT. Le due linee, che crescono aderenti in monostrato, sono state irraggiate sia adese alla fiasca di coltura che in sospensione, dopo trattamento con tripsina, allo scopo di confrontare la radiosensibilità delle cellule nelle due configurazioni di irraggiamento. Le curve dose-sopravvivenza e le analisi del ciclo cellulare hanno evidenziato la effettiva presenza di una diversa radiosensibilità delle cellule irraggiate in sospensione rispetto a quelle in adesione. Cellule esposte in sospensione hanno manifestato una maggior resistenza ed un maggior blocco in fase G2/M che potrebbe essere espressione di una più alta capacità di riparo. Contrariamente, quindi, a quanto indicato dalla metodologia relativa al test di clonogenicità, i risultati ottenuti evidenziano che la radiosensibilità di cellule che crescono in adesione è influenzata dalla modalità di esposizione al trattamento radiante. Questa deve essere pertanto considerata come una variabile aggiuntiva nel confronto dei risultati inter o intralaboratorio. Sulla base dei dati ottenuti sulle due linee cellulari analizzate, allo scopo di ottimizzare gli studi radiobiologici in vitro inerenti la BNCT, si ritiene che sia preferibile effettuare l’irraggiamento delle cellule in adesione in quanto, da un lato, viene mantenuta la condizione di crescita a loro più idonea e dall’altro, essendo questa metodologia più facilmente riproducibile, garantisce una migliore uniformità dei risultati finali.