Generazione di modelli in vitro ed in vivo di osteogenesis imperfecta di tipo XIV mediante CRISPR/Cas9 e loro caratterizzazione

L’Osteogenesis imperfecta (OI) è una patologia ereditaria del tessuto scheletrico a trasmissione autosomica dominante o recessiva, le caratteristiche principali sono ridotta densità e fragilità ossea, presenza di sclere blue, diminuzione della funzionalità polmonare e cardiovascolare. L’OI di tipo XIV è una forma recessiva causata da mutazioni nel gene TMEM38B che codifica per il canale del K+ TRIC-B, situato nella membrana del reticolo endoplasmatico (RE). TRIC-B ha un ruolo nel regolare il flusso degli ioni calcio dal RE al citosol in quanto fornisce lo ione K+ necessario a consentire tale spostamento. Il calcio è importante per il funzionamento di proteine necessarie per il corretto folding del collagene di tipo I e l’alterazione della sua omeostasi compromette la struttura di questa proteina. Mi sono occupata della generazione e caratterizzazione di modelli knock-out, in vitro ed in vivo, di OI di tipo XIV, utilizzando la tecnica CRISPR/Cas9. A tale scopo sono stati selezionati gli RNA guida specifici per il gene TMEM38B umano e per il gene tmem38b di zebrafish. La linea cellulare immortalizzata hFOB 1.19 è stata utilizzata per creare in vitro una linea di osteoblasti umani TMEM38B-/-. Le cellule sono state trasfettate con il plasmide SpCas9(BB)-2A-PURO in cui gli RNA guida specifici per la sequenza umana sono stati clonati. Il plasmide contiene anche la sequenza che consente l’espressione dell’endonucleasi Cas9. I cloni sono quindi stati ottenuti per diluizione seriale delle cellule trasfettate. L’identificazione dei cloni mutati è stata effettuata mediante PCR della regione bersaglio, denaturazione/rinaturazione dell’amplificato e la sua successiva digestione con l’endonucleasi T7 o mediante digestione dell’amplificato con specifici enzimi di restrizione. I cloni mutati sono stati sequenziati e la presenza/assenza della proteina TRIC-B valutata mediante western blot. Alcuni cloni sono stati selezionati per la successiva caratterizzazione. In particolare tutti i cloni mutati analizzati hanno dimostrato un minore rilascio di calcio dal RE rispetto alle cellule controllo, confermando l’assenza dell’attività di TRIC-B. La proliferazione delle cellule mutate è risultata compromessa rispetto ai controlli, così come la loro capacità di mineralizzare, come dimostrato sia mediante colorazione con rosso di alizarina, sia valutando l’attività della fosfatasi alcalina. Mediante q-PCR è stata osservata una riduzione dei livelli di espressione dei marcatori precoci (RUNX2 e OSTERIX/SP7) e tardivi (BGLAP e COL1A1) degli osteoblasti che indica un ritardo nel processo di differenziamento. Infine l’analisi del collagene di tipo I nei cloni mutati ha evidenziato un minor livello di modificazione post traduzionale. Allo scopo di avere anche un modello in vivo dell’OI di tipo XIV si è deciso di generare il knock-out di tmem38b in zebrafish. A questo fine l’RNA guida specifico per il gene tmem38b di zebrafish è stato clonato nel plasmide pT7gRNA. L’RNA guida e l’mRNA per la Cas9 sono stati quindi ottenuti in vitro e microiniettati allo stadio di 2-4 cellule nell’embrione di zebrafish. La presenza della mutazione negli embrioni è stata verificata utilizzando il saggio della T7 sul DNA estratto a 24-48 ore dall’iniezione e i pesci chimera sono stati accoppiati con zebrafish WT. Una linea fondatrice F1, eterozigote per un allele tmem38b con una delezione di 24 nucleotidi è stata selezionata per studi successivi. Gli omozigoti F2 sono stati ottenuti e al momento sono stati analizzati a 7 e 14 giorni. Le dimensioni sono ridotte nei mutati rispetto ai controlli e si è osservato un ritardo di mineralizzazione delle vertebre. Il modello in vitro di osteoblasti umani TMEM38B-/- consentirà di studiare meglio i meccanismi cellulari causati dalla mancanza di TRIC-B e il modello zebrafish tmem38b-/- permetterà di procedere con screening farmacologici al fine di individuare nuovi trattamenti.