Bioreattori cromatografici monolitici a base di enterochinasi per la produzione di proteine ricombinanti a partire da costrutti di fusione

Enterokinase, due to its high cleavage site specificity, is one of the most widely used protease in the process of recombinant fusion protein cleavage. The removal of the Enterokinase from solution reaction mixtures is a key process since even small traces in the final product can lead to a decreased stability and structural modifications. This work is focused on the development and application of different enzyme immobilization techniques on monolithic chromatographic supports to synthesize an enterokinase-based reactor to be used for the preparation of recombinant proteins with the quality and stability standards necessary for therapeutic use. The immobilization is carried on silica-based monolithic chromatographic supports, with epoxy group functionalization; different bond chemistries are carried on to maximize the activity of the immobilized enzyme without losing its cleavage site specificity. The activity of the immobilized enzyme is evaluated firstly on a standard substrate (GD4K-NA) and secondarily on recombinant fusion proteins. For this application recombinant fusion protein containing a Mycobacterium Tuberculosis antigen, namely Ag85B, a potential new tuberculosis vaccine, have been selected. The first immobilization chemistry exploited consists in the covalent interaction between the enzyme and the epoxy-support. This reaction leads to a 53% immobilization yield with 5,3 U of enterokinase immobilized. The activity monitored on the substrate reaches the 100% and the activity on the protein is estimated at 20%. LC-MS characterization of the digested products shows an 11,5% of specifically cleaved Ag85B but also a set of non specific cleavage-site products. The characterization of these products reveals that they come from shifts of the cleavage site in the direction of the Ag85B chain. The second immobilization chemistry studied was based on the idea of solving the specificity problems showed with the first method. This method consists into an additional functionalization of the epoxy-support with the insertion of aldheydic groups to obtain a covalent interaction between the enzyme and the support directed only towards the N-terminal nitrogen of the enzymatic chain. This chemistry gives a 100% immobilization yield with 20 U of enterokinase bound, the activity on the peptidic substrate reaches the 60%. LC-MS characterization of the products shows the presence of protein species released from the fusion construct but deriving from non specific cleavage sites only. Both the reactors are subject to adsorption problems of the fusion protein on the chromatographic support with a significant reduction of the hydrolysis yields. Modifications on the reaction buffer partially overcome the problem while no positive effects on the site-specificity of the cleavage was obtained. The future perspectives consist in an additional immobilization exploiting the epoxy chemistry but with a higher enzyme amount with the rational approach of maximizing the enzyme activity and minimizing the adsorption problems.

L’enterochinasi è una tra le principali proteasi sito-specifiche utilizzate attualmente nei processi di rilascio di proteine ricombinanti dai costrutti di fusione tramite i quali vengono espresse con la tecnica del DNA ricombinante. Comunemente impiegata in soluzione, la sua rimozione dalla miscela di reazione costituisce un passaggio critico poiché tracce di enterochinasi nel prodotto finale possono causarne scarsa stabilità con conseguente alterazione strutturale del prodotto stesso. Il presente lavoro di tesi riguarda lo studio di diverse tecniche di immobilizzazione dell’enzima su supporti cromatografici monolitici per lo sviluppo di un reattore cromatografico a base di enterochinasi utilizzabile per la produzione di proteine ricombinanti di qualità (identità e stabilità) adeguata all’uso terapeutico. L’immobilizzazione dell’enzima è stata condotta su supporti cromatografici di tipo monolitico a composizione silicea, funzionalizzati con gruppi epossidici, sfruttando chimiche di legame differenti al fine di massimizzare l’attività dell’enzima immobilizzato e preservarne la sito-specificità. La valutazione dell’attività dell’enzima immobilizzato è effettuata dapprima su un substrato standard (GD4K-NA) e successivamente su proteine di fusione ricombinanti. In particolare, in questo studio sono usate le proteine di fusione contenenti la proteina Ag85B, noto antigene espresso dal mycobacterium tuberculosis e come tale selezionato per lo sviluppo razionale di nuovi vaccini antitubercolari. La prima chimica di immobilizzazione studiata consiste nell’interazione covalente tra enzima e supporto epossidico. Tale reazione ha portato ad una resa di immobilizzazione del 53%, corrispondente a 5,3 unità di enzima immobilizzato. L’attività misurata sul substrato standard è risultata pari al 100%, mentre quella sulla proteina di fusione è stata stimata al 20%. La caratterizzazione dei prodotti di digestione di tale proteina mediante LC-MS ha evidenziato un 11,5% di prodotto di taglio sito-specifico, ma contemporaneamente anche una serie di tagli aspecifici consecutivi al punto di taglio corretto. La seconda chimica di immobilizzazione ha avuto come razionale quello di risolvere i problemi di aspecificità riscontrati con il precedente metodo e consiste in un’ulteriore funzionalizzazione del supporto epossidico mediante l’inserimento di gruppi aldeidici nel tentativo di ottenere un’interazione covalente tra enzima e supporto con una selettività specifica verso l’azoto N-terminale della catena amminoacidica enzimatica. Questa chimica di legame ha dato un’immobilizzazione del 100% (20 U di enzima immobilizzato), ed un’attività nei confronti del substrato peptidico pari al 60%. La caratterizzazione dei prodotti di digestione della proteina ha evidenziato la presenza di specie proteiche rilasciate dal costrutto di fusione, ma provenienti da una serie di tagli aspecifici senza presenza di prodotto di digestione corretto. Entrambi i bioreattori si sono inoltre dimostrati soggetti a problematiche di adsorbimento aspecifico della proteina di fusione sul supporto cromatografico, con una riduzione significativa delle rese di digestione. La modifica dell’ambiente di reazione ha parzialmente risolto queste problematiche senza però avere effetto positivo sulla specificità di taglio. La direzione intrapresa in futuro consiste nell’eseguire un’ulteriore immobilizzazione sfruttando la chimica di legame epossidica ma aumentando la quantità di enzima immobilizzato nel tentativo di massimizzare l’attività dell’enzima e minimizzare i problemi di adsorbimento.