La modulazione farmacologica della via Nrf2/HO-1 nell'epitelio pigmentato retinico come strategia terapeutica per la degenerazione maculare senile

Age-related macular degeneration (AMD) is a disease caused by a progressive deterioration of the macula, the central portion of the retina, which is responsible for the finest and discriminated vision. There are two clinical forms of AMD: non-exudative or dry form, and exudative or wet form. These two forms present different phenotypes but share a common element: the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, endowed with several key functions for retinal homeostasis. The study of risk factor for the AMD onset highlighted the crucial role played by the oxidative stress, that is an imbalance between antioxidant and pro-oxidant agents. The Keap1/Nrf2/ARE pathway represent the main regulator of antioxidant and cytoprotective response in RPE exposed to endogenous and exogenous stresses caused by reactive oxygen species (ROS). In basal conditions, the nuclear transcription factor Nrf2 is sequestered in the cytoplasm by the protein Keap1, which favours its degradation via proteasome. In the presence of ROS, Keap1 undergoes a structural change that determines the activation of Nrf2, which translocates in to the nucleus and binds the antioxidant response element (ARE), thus favouring the expression of target genes, such as HO-1 (Heme Oxygenase-1). In nature there are several molecules, such as polyphenols, having direct and indirect antioxidant activity, capable of inducing the gene expression of antioxidant proteins through the activation of Nrf2, including curcumin. Curcumin structure, together with diallyl sulfide, a compound derived from garlic, represented the starting point for the synthesis of some Nature-Inspired Hybrids (NIH) as Nrf2 activators. This thesis is an in vitro study of four NIH compounds in ARPE-19 cells; in particular their ability to activate the Nrf2/HO-1 pathway and their cytoprotective effect in oxidative stress conditions were evaluated. The results obtained showed that the compound NIHs are well tolerated by ARPE-19 cells, are able to induce the nuclear translocation of Nrf2 and the consequent expression of HO-1, although with different modalities and times between the various molecules. Furthermore, an interesting direct and indirect antioxidant activity and an improvement in cell viability by the compounds in H2O2-exposed cells were detected. There data encourage further studies on the protective activity exerted by NIH compounds and confirm that Nrf2/HO-1 pathway modulation as a potential interesting therapeutic target for AMD, whose etiology is not fully elucidated and effective treatment is still an unmet medical need.

La degenerazione maculare senile (Age-related Macular Degeneration, AMD) è una patologia causata dal progressivo deterioramento della macula, la porzione centrale della retina responsabile della visione più fine e dettagliata. L'AMD si presenta in due forme cliniche distinte: la forma non essudativa, o secca, e la forma essudativa o umida. Queste due forme, seppur con fenotipi diversi, sono accumunate da un elemento chiave, ovvero la degenerazione delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (Retinal Pigment Epithelium, RPE), che esplicano numerose funzioni essenziali per il mantenimento dell'omeostasi retinica. Lo studio dei fattori di rischio ha messo in luce il ruolo fondamentale esercitato dallo stress ossidativo, la condizione di squilibrio tra gli agenti antiossidanti e gli agenti pro-ossidanti nell'insorgenza di questa patologia. La via Keap1/Nrf2/ARE costituisce il principale regolatore delle risposte antiossidanti e citoprotettive nelle RPE in presenza di stress endogeni ed esogeni causati dalle specie reattive dellossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS). In condizioni basali, il fattore di trascrizione nucleare Nrf2 è sequestrato nel citoplasma dalla proteina Keap1, che ne favorisce la degradazione via proteasoma. In presenza di ROS, Keap1 subisce un cambiamento strutturale che determina l'attivazione di Nrf2, che trasloca nel nucleo, lega sequenze di DNA specifiche (l'elemento di risposta antiossidante, Antioxidant Response Elements, ARE) favorendo l'espressione di geni bersaglio, tra i quali HO-1 (Heme Oxygenase-1). In natura esistono svariate molecole, come i polifenoli, aventi attività antiossidante diretta ed indiretta, in grado di indurre l'espressione genica di proteine antiossidanti attraverso l'attivazione di Nrf2. Tra questi vi è la curcumina, che insieme al diallil solfuro, un composto derivato dall'aglio, ha rappresentato il punto di partenza per la sintesi di composti ibridi (Nature Inspired Hybrids, NIH), attivatori di Nrf2, oggetto di studio di questa tesi. Nel presente lavoro di tesi sono stati saggiati quattro composti NIH in una linea cellulare umana di RPE, le ARPE-19, e sono stati studiati: la loro capacità di attivare la via Nrf2/HO-1 ed il loro effetto citoprotettivo in condizioni di stress ossidativo. I risultati ottenuti hanno evidenziato che i composti con questi gruppi funzionali attivi nella molecola sono ben tollerati dalle cellule ARPE-19, sono in grado di indurre la traslocazione nucleare di Nrf2 e, a valle, la conseguente espressione di HO-1, sebbene con modalità e tempi differenti tra le varie molecole. Inoltre è stata rilevata un'interessante proprietà antiossidante diretta ed indiretta dei composti ed un miglioramento da essi indotto della vitalità cellulare in cellule esposte allo stimolo tossico H2O2. I dati ottenuti incoraggiano ulteriori studi sull'attività protettiva esercitata dai composti NIH e confermano che la modulazione della via Nrf2/HO-1 rappresenta un target terapeutico per l'AMD, una patologia la cui eziologia non è stata del tutto chiarita e che ad oggi rappresenta ancora una sfida per la medicina.