Generazione e caratterizzazione di nuovi modelli di zebrafish di forme recessive di osteogenesis imperfecta

Introduction. Osteogenesis imperfecta (OI) is a rare genetic disorder characterized by skeletal abnormalities, including short stature, bone deformity and frequent fractures even in absence of trauma. Cartilage-associated protein (CRTAP) and Prolyl 3-hydroxylase 1 (P3H1), together with Cyclophylin B (CyPB), are components of the collagen prolyl 3-hydroxylation complex, involved in the hydroxylation of specific proline residues in collagen type I  chains. Loss-of-function mutations in CRTAP and P3H1 result in the recessive OI types VII and VIII, respectively. Nowadays, no definitive pharmacological therapy is available for OI. Since the mechanisms underlying the disease are still poorly understood, new in vivo models are required to deeply investigate the molecular basis of osteogenesis imperfecta. The teleost Danio rerio is an appealing animal model to study human diseases thanks to the high level of genome conservation shared with mammals. Furthermore, the preservation of bone cells differentiation pathways and ossification processes in teleosts and tetrapods makes zebrafish a good organism to study skeletal diseases. Using the CRISPR/Cas9 genome editing tool, crtap and p3h1 knock-out zebrafish were generated and validated as models for OI type VII and VIII, respectively. Results. p3h1 and crtap knock-out zebrafish models were successfully generated using the CRISPR/Cas9 system. Starting from the first weeks post fertilization they are shorter respect to wild-type. In adult fish X-Ray analysis and µCT scans reveal severe bone deformities. Moreover, morphometric measurements show body and head disproportions in mutants compared to wild-type. In both p3h1-/- and crtap-/- a delay is observed at the level of the cranial as well as of the vertebral bones. In addition, p3h1 knock-out reveal a delay in bone formation during the regeneration of caudal fin rays respect to controls. Collagen type I is overmodified in p3h1-/- and crtap-/- models, likely due to the retention of the protein in the endoplasmic reticulum cisternae, which were actually found enlarged in p3h1-/- fish. Electron microscopy analysis shows smaller diameters of collagen type I fibers and both collagen type I and type II fibrils disorganization. Conclusion. The molecular, biochemical and morphological characterization of crtap and p3h1 knock-out mutants support their goodness as models for OI type VII and VIII, respectively. Using more animals and reducing costs and time, our zebrafish models will be extremely powerful to test new pharmacological approaches to pave the way for a valid therapy for osteogenesis imperfecta.

Introduzione. L’osteogenesis imperfecta (OI) è una malattia genetica rara. I pazienti sono soggetti a frequenti fratture anche in assenza di traumi, deformità scheletriche e presentano un ritardo della crescita. Le proteine Cartilage-associated protein (CRTAP) e Prolyl 3-hydroxylase 1 (P3H1), insieme a Cyclophylin B (CyPB), sono i componenti del complesso presente nel reticolo endoplasmatico e responsabile dell’idrossilazione in posizione C-3 di specifici residui di prolina sulle catene  del collagene di tipo I. Mutazioni in CRTAP e P3H1 causano rispettivamente le forme recessive di OI di tipo VII e VIII. Ad oggi non esiste alcuna terapia farmacologia definitiva per il trattamento dell’OI. I meccanismi responsabili della malattia sono ancora poco chiari, quindi nuovi modelli in vivo sono necessari per individuare le basi molecolari della malattia. Lo zebrafish (Danio rerio) è diventato un valido organismo modello per lo studio di diverse patologie umane grazie all’elevato livello di omologia tra il suo genoma e quello dei mammiferi. Inoltre, i teleostei posseggono gli stessi meccanismi di differenziamento delle cellule dell’osso e gli stessi processi di ossificazione descritti nei mammiferi, quindi lo zebrafish si è affermato come ottimo modello anche per lo studio delle malattie scheletriche. Mediante il sistema di modificazione genetica CRISPR/Cas9, due zebrafish knock-out per Crtap e P3h1 sono stati generati e caratterizzati sia da un punto di vista biochimico che morfologico. Risultati. I modelli di zebrafish crtap-/- e p3h1-/- sono stati generati utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. A partire dalla prima settimana dopo la fecondazione, i mutanti sono più corti dei controlli. Radiografie e scansioni ottenute con il µCT su pesci crtap-/- e p3h1-/- adulti evidenziano gravi deformità ossee. Le misure morfometriche dimostrano la presenza di sproporzioni a livello del corpo e della testa nei mutanti rispetto ai controlli. Un significativo ritardo nella mineralizzazione ossea contraddistingue le ossa del cranio e lo sviluppo della colonna vertebrale dei mutanti. Inoltre, p3h1-/- mostra un ritardo nella rigenerazione dei raggi della coda in seguito ad amputazione, rispetto ai controlli. L’analisi mediante SDS-PAGE del collagene di tipo I evidenzia la presenza di overglicosilazione nei modelli p3h1-/- e crtap-/-. L’overmodificazione può essere causata dalla ritenzione della proteina nelle cisterne del reticolo endoplasmatico che, mediante microscopia elettronica, sono infatti risultate allargate in p3h1-/-. L’analisi a microscopia elettronica ha dimostrato inoltre la presenza di fibre di collagene più piccole e disorganizzate in p3h1-/-. Conclusione. Entrambi i modelli crtap-/- e p3h1-/- sono stati caratterizzati dal punto di vista molecolare, biochimico e morfologico e risultano essere validi modelli per lo studio dell’OI di tipo VII e VIII. Con la possibilità di utilizzare più animali, riducendo i costi e il tempo di lavoro, i nostri modelli di zebrafish potranno essere utilizzati per testare nuovi approcci farmacologici per la cura dell’osteogenesis imperfecta.