Cellulose, the main component the plant cell wall, is the most abundant renewable source of reduced carbon in the world. This polymer is highly resistant to degradation but several classes of enzymes that are able to saccharify cell-wall polymers occur in nature. Such enzymes can be classified as cellulases, xylanases, pectinases, on the basis of their substrate. They are of high interest for the transformation of ligno-cellulosic biomass into biofuels. However, the use of cellulolytic enzymes, produced through microbial fermentation, is one of the major costs that impact on the sustainability of biofuel production. A very promising way to produce recombinant enzymes at a low cost is plant molecular farming. This method is based on the transformation of either nuclear or plastid genomes of the plant cell. In particular, plastid transformation of Nicotiana tabacum is advantageous in terms of the accumulation level of the recombinant protein. The laboratory where I performed this thesis work previously obtained a tobacco transplastomic line overexpressing the endocellulase CelK1 of Paenibacillus spp. (Longoni et al. 2015). This aim of this thesis was the in-depth analysis of the CelK1 line from both molecular and biochemical point of view. In particular the level of hetheroplasticity of transplastomic plants and calli grown under different conditions was evaluated by PCR e qPCR. Moreover, the cellulase (CMCase) activity of transplastomic tobacco extracts was measured after long-term storage at 4°C. The proteomic profile of CelK1 cell extracts was determined through 2-DGE analyses and compared to the wild type one, also in relation to possible post translation modification of the recombinant protein.
La cellulosa, la componente principale della parete delle cellule vegetali, è la fonte rinnovabile più abbondante di carbonio ridotto nel mondo. Questo polimero è altamente resistente alla degradazione, tuttavia esistono in natura diverse classi di enzimi che sono in grado di saccarificare i polimeri della parete cellulare. Tali enzimi possono essere classificati come cellulasi, xilanasi, pectinasi, sulla base del loro substrato. Sono di grande interesse per la trasformazione della biomassa ligno-cellulosa nei biocarburanti. Tuttavia, l'utilizzo di enzimi cellulolitici, prodotti tramite fermentazione microbica, è uno dei maggiori costi che incidono sulla sostenibilità della produzione di biocarburanti. Un modo molto promettente per produrre enzimi ricombinanti a basso costo è il plant molecular farming. Questo metodo si basa sulla trasformazione di genomi nucleari o plastidi della cellula vegetale. In particolare, la trasformazione di plastidio di Nicotiana tabacum è vantaggiosa in termini di livello di accumulo della proteina ricombinante. Il laboratorio in cui ho eseguito questa tesi ha precedentemente ottenuto una linea transplastomica di tabacco che overesprimenva l’endocellulasi CelK1 di Paenibacillus spp. (Longoni et al., 2015). L’obiettivo di questa tesi è stato l'analisi approfondita della linea CelK1, sia dal punto di vista molecolare che biochimico. In particolare il livello di eteroplasticità di piante transplastomiche e calli coltivati in condizioni diverse è stato valutato mediante PCR e qPCR. Inoltre, l'attività cellulasica (CMCase) degli estratti di tabacco transplastomici è stata misurata dopo un mantenimento a lungo termine a 4 ° C. Il profilo proteomico degli estratti cellulari CelK1 è stato determinato mediante analisi 2-DGE e confrontato con il wild type, anche in relazione ad una possibile modifica post-traduzionale della proteina ricombinante.
Molecular farming: analisi bio-molecolare di una linea transplastomica di Nicotiana tabacum esprimente una endoglucanasi batterica
GERACE, DOMENICO
2016/2017
Abstract
Cellulose, the main component the plant cell wall, is the most abundant renewable source of reduced carbon in the world. This polymer is highly resistant to degradation but several classes of enzymes that are able to saccharify cell-wall polymers occur in nature. Such enzymes can be classified as cellulases, xylanases, pectinases, on the basis of their substrate. They are of high interest for the transformation of ligno-cellulosic biomass into biofuels. However, the use of cellulolytic enzymes, produced through microbial fermentation, is one of the major costs that impact on the sustainability of biofuel production. A very promising way to produce recombinant enzymes at a low cost is plant molecular farming. This method is based on the transformation of either nuclear or plastid genomes of the plant cell. In particular, plastid transformation of Nicotiana tabacum is advantageous in terms of the accumulation level of the recombinant protein. The laboratory where I performed this thesis work previously obtained a tobacco transplastomic line overexpressing the endocellulase CelK1 of Paenibacillus spp. (Longoni et al. 2015). This aim of this thesis was the in-depth analysis of the CelK1 line from both molecular and biochemical point of view. In particular the level of hetheroplasticity of transplastomic plants and calli grown under different conditions was evaluated by PCR e qPCR. Moreover, the cellulase (CMCase) activity of transplastomic tobacco extracts was measured after long-term storage at 4°C. The proteomic profile of CelK1 cell extracts was determined through 2-DGE analyses and compared to the wild type one, also in relation to possible post translation modification of the recombinant protein.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/22643