3D Bioprinting: a new perspective in the study of pathogenesis of ALS. (Stampa biologica 3D: una nuova prospettiva nello studio della patogenesi della SLA.)

My work focused on the use of 3D Bioprinting in the study of neurodegenerative diseases, and in particular in Amyotrophic lateral sclerosis (ALS). 3D Bioprinting is a new approach both in the study of different pathologies and in precision medicine. At the beginning we developed a bioink, composed by sodium alginate and gelatin, which guarantees cell viability and growth. After that, we tested different pressures and temperatures for the printing, and we tested different methods of sterilization for our bioink. We found that the best bioink was the one composed by 6% sodium alginate and 4% gelatin, printed at 25°C with a pressure between 45 and 70 kPa, and sterilized by pasteurization at 72°C. We then tested the viability of SH-SY5Y cells and their organization in the 3D structure. We confirmed that the bioink allows cell viability and proliferation, and the maintenance of cell organization. After that, we established a protocol for the reprogramming of fibroblasts, from both healthy controls and ALS patients, into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and their differentiation firstly in neural stem cells (NSCs) and then in motor neurons (MNs). We tested the optimal reprogramming and differentiation by immunofluorescence and RT-qPCR and at the end we verified the vitality of iPSCs and NSCs into the 3D structures. We demonstrated another time that printing did not affect cell viability and moreover, we found that in NSCs into the printed structure increased cell proliferation in comparison with the situation before printing. Future goals are the printing of MNs, the differentiation of iPSCs and NSCs into the hydrogel and the electrophysiological characterization of motoneurons cultured into the 3D structure.

Il mio elaborato di laurea verte sull’utilizzo della stampa 3D nello studio delle malattie neurodegenerative e per la precisione nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Negli ultimi anni, infatti, la stampa 3D è emersa come una nuova prospettiva non solo per lo studio delle diverse patologie ma anche per lo sviluppo di tessuti utilizzabili in medicina di precisione. È stato prima creato un bioink, composto da sodio alginato e gelatina, che garantisse la vitalità e la crescita cellulare. In seguito, sono state testate le migliori condizioni di stampa sia per quanto riguarda la pressione e la temperatura, sia per quanto riguarda il processo di sterilizzazione dell’hydrogel. Il bioink che si è scoperto aver maggiori qualità di stampa è stato quello composto da sodio alginato al 6% e da gelatina al 4%, sterilizzati mediante pastorizzazione a 72°C e stampati a 25°C con una pressione tra 45 e 70 kPa. Inizialmente è stata valutata la vitalità di cellule SH-SY5Y e, mediante immunofluorescenza, la loro organizzazione all’interno del costrutto 3D. Il bioink mantiene una buona vitalità e permette l’organizzazione cellulare. Successivamente è stato sviluppato un protocollo per la riprogrammazione dei fibroblasti, ottenuti da controlli sani e pazienti affetti da SLA, in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e infine per il loro differenziamento prima in cellula staminali neurali (NSCs) e in motoneuroni (MN). La conferma di avvenuto differenziamento e riprogrammazione è stata effettuata sia mediante immunofluorescenza sia mediante RT-qPCR. Infine, sia iPSCs che NSCs sono state stampate nell’hydrogel ed è stato analizzato il loro grado di proliferazione. Anche in questo caso, come in quello delle SH-SY5Y, la vitalità è mantenuta, e, anzi, nel caso delle NSCs il grado di proliferazione aumenta se confrontato con quello in 2D. Gli obbiettivi futuri sono quelli di stampare anche i motoneuroni per testarne la vitalità, di effettuare il differenziamento delle iPSCs e delle NSCs direttamente nel costrutto 3D e di testare le caratteristiche elettrofisiologiche dei motoneuroni così ottenuti.