Evaluation of Amphotericin B polymer micelle formulation and synthesis of Amphotericin B polymer conjugates in a vaccine adjuvant setting

Valutazione di micelle polimeriche caricate con Amfotericina B e sintsi di coniugati Amfotericina B-polimero come adiuvanti nello sviluppo formulativo di vaccini Riassunto Nello scorso decennio la continua ricerca per lo sviluppo di nuovi vaccini ha promosso lo studio parallelo di nuovi adiuvanti sicuri ed efficaci, molecole in grado di stimolare una risposta potente contro patogeni e antigeni del cancro. Recentemente l’amfotericina B, un farmaco già approvato dalla FDA per il trattamento di infezioni fungine sistemiche, ha dimostrato di possedere la capacità di stimolare il sistema immunitario tramite l’attivazione dei TLRs. Tuttavia, l’antibiotico presenta due importanti problematiche: da una parte la sua scarsa solubilità in solventi acquosi, dall’altra la sua elevata citotossicità. Nel laboratorio del Prof. Dr. Bruno De Geest dell’università ospitante, è stata sviluppata una formulazione basata su copolimeri a blocchi per rispondere a queste problematiche. La nuova classe di polimeri sintetizzata ha dimostrato di possedere la capacità di auto assemblarsi a temperatura ambiente e di creare nanoparticelle polimeriche capaci di incapsulare l’amfotericina B. La formulazione così ottenuta è stata capace di ridurre in vitro l’elevata tossicità del farmaco e contemporaneamente migliorare la sua bassa solubilità in acqua. La formulazione ha dato inoltre risultati promettenti in vivo in un confronto con un potente adiuvante di riferimento. In questo progetto abbiamo messo a confronto la citotossicità della formulazione e la sua attività immunostimolante con quella di altri tre prodotti commerciali a base di amfotericina B (Amp-PLP, Fungizone® and Ambisome®) in un vasto range di concentrazioni. I risultati non sono stati in linea con quelli ottenuti durante lo sviluppo delle nanoparticelle polimeriche. Il copolimero a blocchi ha mantenuto la capacità dell’amfotericina B di attivare i TLRs, ma ha mostrato un andamento tossico comparabile a quello della formulazione standard di riferimento Fungizone®. Abbiamo poi investigato la struttura sopramolecolare adottata dal farmaco nelle formulazioni testate cercando di verificare se qualcuna di queste potesse essere associata ad una forma specifica. Infatti, è noto che l’amfotericina B in ambiente acquoso costituisce aggregati con differenti profili di sicurezza. Tuttavia, i nostri risultati indicano che nessuna delle formulazioni analizzate, è in grado di stabilizzare le strutture considerate meno tossiche cioè la forma monomerica e quella superaggregata. Al contrario, tutti i sistemi testati mostrano una miscela di vari stati di aggregazione di difficile attribuzione. Nella seconda parte di questo lavoro, presentiamo un nuovo approccio per superare i problemi di citotossicità e solubilità dell’amfotericina B. Abbiamo progettato un coniugato farmaco-polimero dinamico che speriamo possa solubilizzare l’amfotericina B e andare incontro ad idrolisi a valori di pH endosomiali, ottenendo un rilascio controllato. Siamo dunque partiti con la ricerca di una via di sintesi polimerica efficace: il risultato è stato la sintesi tramite omopolimerizzazione RAFT di due nuove serie di polimeri idrofili con basso indice di polidispersione capaci di legare l’amfotericina B in condizioni basiche. Per riassumere, abbiamo lavorato con due approcci differenti cercando di risolvere le principali limitazioni nell’uso dell’amfotericina B come sicuro ed efficace adiuvante per lo sviluppo di nuovi vaccini. Per prima cosa abbiamo esteso la valutazione di una formulazione micellare polimerica già testata. In un secondo tempo, abbiamo sintetizzato un coniugato polimero-amfotericina B.