Ottimizzazione della terapia di riduzione del substrato mediata da CRISPR/Cas9 per il trattamento in vivo della Iperossaluria Primitiva di tipo 1

CRISPR/Cas9 technology has emerged as a promising tool to treat genetic disorders. Recently, a CRISPR/Cas9-based therapy for the metabolic disorder Primary Hyperoxaluria type 1 (PH1) was developed. PH1 patients present mutations in AGXT gene causing hepatic alanine-glyoxylate aminotransferase (AGT) deficiency and leading to overproduction of oxalate, which is accumulated in kidneys causing life-threatening renal damage. AAV vector-delivered CRISPR/Cas9 was used to inhibit glycolate oxidase (GO), enzyme implicated in the synthesis of glyoxylate (precursor of oxalate), which resulted in decreased urine oxalate levels and prevention of kidney damage in mice. Nevertheless, concerns regarding the adverse effects of CRISPR/Cas9 therapies led us to develop several in vivo strategies to control gene editing, on-target efficacy and avoid off-targets mutagenesis. First, the efficiency and safety of gene editing were studied in animals of different ages, finding adulthood the best condition for treatment. Additionally, two different strategies to improve gene editing safety were tested: the combination of two gRNAs targeting nearby regions in presence of the fully functional SaCas9 or in presence of nickase SaCas9. First, it was found that the SaCas9 in presence of two gRNAs is able to generate a predictable genome editing in the targeted region, avoiding unwanted modifications. The second strategy is considered a safer approach in terms of avoiding off-target modifications and it was demonstrated that the effect over on-target indels and GO inhibition was maintained. Finally, it was investigated the capability of SaCas9 to modify mRNAs with the aim of increasing editing safety, avoiding permanent DNA modifications. However, it was concluded that the SaCas9 is not able to modify mRNA. In conclusion, CRISPR/Cas9-mediated SRT was optimized for more efficient and safer in vivo PH1 treatment.

La tecnologia di CRISPR/Cas9 è considerata essere un promettente strumento per il trattamento delle malattie genetiche. Recentemente, è stata sviluppata una terapia mediata da CRISPR/Cas9 per la cura della Iperossaluria Primitiva di tipo 1 (PH1), un raro disordine metabolico. Pazienti affetti da PH1 sono soggetti a mutazioni nel gene AGXT, le quali comportano un deficit dell’enzima alanina-gliossilato aminotransferasi (AGT). Tale difetto conduce all’over produzione di ossalato, causando danni renali che possono compromettere la vita del paziente. Il sistema AAV-CRISPR/Cas9 è stato adottato per l’inibizione dell’enzima glicolato ossidasi (GO) implicato nella sintesi del gliossilato (precursore dell’ossalato) avendo come effetto ultimo la riduzione dei livelli urinari di ossalato e la prevenzione del danno renale in topo. Tuttavia, preoccupazioni relative ai potenziali effetti avversi dovuti alla terapia mediata da CRISPR/Cas9 ci hanno indotti a sviluppare diverse strategie in vivo, allo scopo di migliorare il controllo del gene-editing e l’efficienza on-target, impedendo la comparsa di mutazioni off-target. In primo luogo, l’efficacia e la sicurezza dell’editing è stata studiata in animali di età differente, definendo l’età adulta come la migliore condizione per il trattamento. In secondo luogo, sono state testate due strategie finalizzate all’incremento della sicurezza dell’editing genico: la combinazione di due gRNAs complementari a regioni adiacenti il target, rispettivamente in presenza della versione WT o nickase di SaCas9. I risultati del trattamento hanno permesso di verificare che WT-SaCas9, in presenza di due gRNAs, fosse in grado di generare l’effetto di genome-editing prospettato a livello della regione target, impedendo l’insorgenza di modificazioni indesiderate. La seconda strategia, basata sulla versione nickase e considerata come un approccio maggiormente sicuro per l’esclusione delle modificazioni off-target, ha dimostrato di conservare l’efficacia on-target di SaCas9 e la conseguente inibizione di GO. Infine, è stato investigato l’effetto di SaCas9 sugli mRNAs con l’obbiettivo di incrementare la sicurezza dell’editing, impedendo la generazione di modificazioni permanenti a livello genomico. Tuttavia, si è concluso che SaCas9 non abbia alcun effetto diretto sull’mRNA complementare. I positivi esiti raccolti hanno permesso di concludere che la terapia di riduzione del substrato condotta da CRISPR/Cas9 sia stata ottimizzata, risultando più efficiente e sicura per il trattamento di PH1.