Sviluppo e convalida di una metodica analitica UHPLC idonea all’identificazione e alla quantificazione di un amminoacido a catena ramificata

The purpose of this research is to identify an UHPLC method suitable for a quick identification and quantification of the branched chain amino acid (BCAA) leucine, the active principle of a product under development in the pharmaceutical industry E-Pharma Trento. Experimental work was totally carried out in the research and development laboratories of the pharmaceutical company. To enable the Ultraviolet-Visible detection of leucine, activities were firsty focused on the optimization of the derivatization reaction of the amino acid. To this aim 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) was employed as derivatizing agent combined with Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB). An UHPLC method suitable for the quick identification and quantification of leucine was then developed. To this aim different chromatographic columns were tested and the elution conditions were optimized, changing different parameters: i) pH of the mobile phase, ii) gradient , iii) column temperature and iv) flow rate. The optimized chromatographic conditions were finally submitted to the method validation in accordance with Guidelines of “International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use” ICH Q2 (R1). Particularly, method validation concerned the evaluation of specificity, precision - in terms of repeatability and intermediate precision -,accuracy, linearity and robustness. Method validation clearly demonstrates that the method is specific, precise, accurate, robust and linear in the range of 0,071 – 0,213 mg/ml. Therefore, the method is suitable for the identification and the quantification of the branched chain amino acid leucine. Interestingly,that the method developed will be used in future in E-Pharma company for the quality control of a complex pharmaceutical product containing leucine, avoiding preliminary extraction procedures or the use of a complex HPLC detector.

Il lavoro svolto in questa tesi nasce dall’esigenza di disporre di una metodica per UHPLC idonea all’identificazione e alla quantificazione di un amminoacido ramificato (BCAA), la leucina, presente in un integratore alimentare in via di sviluppo presso l’azienda E-Pharma Trento. L’attività sperimentale è stata interamente svolta presso i laboratori di Ricerca e Sviluppo della stessa azienda. Al fine di rendere l’amminoacido leucina rilevabile mediante l’impiego di un rivelatore UV/VIS, è stata inizialmente messa a punto e ottimizzata una reazione di derivatizzazione che prevede l’impiego di 1-fluoro-2,4 dinitrobenzene (DNFB), quale agente derivatizzante, e di operare in ambiente basico in presenza di Esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB). L’attività svolta ha successivamente riguardato la messa a punto di un metodo UHPLC idoneo all’identificazione e alla quantificazione, in un breve intervallo di tempo e con la massima efficienza possibile, dell’amminoacido ramificato leucina nel granulato, che costituisce l’integratore alimentare oggetto di studio. A tale scopo sono state sperimentate diverse colonne cromatografiche e sono state ottimizzate le condizioni di eluizione, modificando diversi parametri quali i) il pH della fase mobile, ii) il gradiente di eluizione, iii) la temperatura della colonna e iv) la velocità di flusso. Le condizioni cromatografiche ottimizzate sono state infine sottoposte a convalida, operando in accordo alle linee guida della ”International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use” ICH Q2 (R1). In particolare, la convalida del metodo sviluppato ha previsto la valutazione di specificità, precisione – in termini di ripetibilità e precisione intermedia-, accuratezza, linearità e robustezza. La convalida ha chiaramente dimostrato che il metodo sviluppato è specifico, preciso, accurato, robusto e lineare nel range di concentrazioni 0,071 - 0,213 mg/ml, e pertanto idoneo all’identificazione e alla quantificazione dell’amminoacido leucina nel granulato oggetto di studio. E’ interessante notare che il metodo UHPLC sviluppato e convalidato in futuro verrà utilizzato presso l’Azienda E-Pharma per il controllo qualità di una formulazione farmaceutica complessa contenente leucina senza dover impiegare procedure estrattive preliminari o utilizzare rivelatori complessi.