L’inibizione farmacologica di GLAST, glutamate aspartate transporter, riduce la progressione tumorale in un modello murino di glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most aggressive brain tumor: treatment with surgery , radiotherapy and chemotherapy with temozolomide is associated to 15 months overall survival. Brain edema and invasive capacity are major determinants of GBM lethality. High levels of glutamate are associated to both features. Glioblastoma takes advantage of glutamate release paving the way to tumorigenic cells. We have investigated the role of GLAST, glutamate aspartate transporter, in glioblastoma. GLAST, an astrocyte transporter physiologically devoted to glutamate uptake, is expressed on the surface of GB cells and constitutes another important weapon by which GBM cells migrate and invade normal surrounding tissue. By the exploitation of a developed culture system which allows the generation and the expansion of GB cells as neurospheres in the presence of mitogenic factors (also defined as glioma stem cells, GSCs) in vitro we discovered that despite the expression of GLAST GSCs are not able to uptake glutamate. Inhibition of GLAST expression by shRNA technology reduced glutamate release in vitro and limited tumor invasion and progression in xenograft models. Magnetic resonance spectroscopy (MRS) showed higher concentration of glutamate in mice injected with GLAST enriched cells compared to those injected with GLAST depleted cells. These increased levels of glutamate anticipate detection of the tumor mass by magnetic resonance imaging (MRI). We also found that increased expression of GLAST was associated to the loss of Na+/K+-ATPase expression, whose activity maintains the electrochemical gradient necessary for glutamate uptake. Pharmacological targeting of GLAST using UCPH-101, the commercially available specific allosteric inhibitor, showed an in vitro increase of apoptosis in GBM cells but not in astrocytes. In mice with intracranial gliomas a single intratumor injection of UCPH-101 was sufficient to increase survival. These results provide a preliminary background for translational research leading to the identification of novel GLAST inhibitors able to cross the blood-brain barrier. The significant correlation between GLAST expression and decreased survival of GBM patients supports its candidacy as a clinical marker and a novel therapeutic target.

Tra i tumori cerebrali, i glioblastomi (GBM) sono i più maligni e pressoché incurabili a causa della loro elevata capacità invasiva che porta all’inevitabile insorgenza di recidive. Uno dei meccanismi sfruttati dai GBM per farsi strada tra le cellule cerebrali normali è il rilascio di glutammato, il suo metabolismo e trasporto sono profondamente alterati nei GBM. Finora il rilascio di glutammato da parte delle cellule di glioma è stato attribuito ad un trasportatore in grado di importare cistina e rilasciare glutammato permettendo alle cellule tumorali di proliferare e migrare, causando insorgenza di crisi epilettiche e formazione di edema. Nel nostro studio abbiamo osservato che GLAST, un trasportatore espresso dagli astrociti e fisiologicamente deputato alla captazione di glutammato, viene espresso dai GBM e che questa espressione, valutata su tessuti di GBM, correla con una minor sopravvivenza dei pazienti. Sfruttando inoltre un sistema di coltura di cellule a partire da GBM dopo intervento chirurgico in forma di neurosfere (GSCs) abbiamo scoperto che, nonostante l'espressione di GLAST, le GSCs non sono in grado di captare glutammato. L'aumento dell'espressione di GLAST inoltre è associato alla perdita di espressione della pompa Na+-K+ATPasi, la cui attività fisiologica è quella di mantenere il gradiente elettrochimico necessario per la captazione di glutammato. La sua assenza determina un’ inversione nel trasporto di glutammato da parte delle GSCs che è rilasciato quindi nell’ambiente circostante. Abbiamo sottoposto a separazione immunomagnetica la linea GL261 di glioma murino ottenendo tre sottopopolazioni cellulari: GL261 GLAST+, GLAST- e non immunoseparate. In vivo le GLAST+ si sono dimostrate significativamente più tumorigeniche. La risonanza magnetica a diversi tempi ha dimostrato che i tumori da GSCs GLAST+ non solo attecchiscono più rapidamente, ma hanno anche un’elevatissima capacità infiltrante rispetto ai gliomi da GSCs GLAST-. Mediante spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) abbiamo dimostrato la presenza di una maggiore concentrazione di glutammato nei due emisferi di topi inoculati con cellule GL261 GLAST-arricchite rispetto a quelli inoculati con cellule GLAST-deplete. Questi aumenti dei livelli di glutammato si sono dimostrati in grado di anticipare la rilevazione della massa tumorale mediante risonanza magnetica. Per valutare il ruolo funzionale di GLAST ne abbiamo silenziato l’espressione in una linea recidiva di glioblastoma. In vitro la proliferazione e la migrazione si riducono significativamente. In vivo l’inibizione dell’espressione di GLAST ha un forte impatto sulla sopravvivenza e l’analisi istologica dei tumori ha confermato il coinvolgimento di GLAST nella proliferazione, ma in particolare nella migrazione e invasione. Inoltre, l'inibizione dell'espressione di GLAST riduce il rilascio di glutammato in vitro e limita significativamente la capacità invasiva e la progressione in modelli di xenotrapianto. Abbiamo testato su cellule di glioma l’inibitore allosterico UCPH-101 GLAST selettivo. In vitro, l’inibizione di GLAST aumenta significativamente l'apoptosi in neurosfere da GL261 e da tre GBM umani, ma non in astrociti. In vivo, una singola somministrazione intratumorale di UCPH-101 nove giorni dopo l’impianto delle cellule GL261 ha indotto un effetto parziale determinando zone necrotiche nel tumore dei trattati. In conclusione, GLAST è un nuovo importante candidato marcatore clinico e nuovo bersaglio terapeutico espresso dai GBM.