Sperm cryopreservation has been recognized as a key strategy for preservation of fertility in males. Neverthless, current protocols of semen freezing are neither optimal nor standardized between different labs. In this study we compare some protocols of human spermatozoa cryopreservation applying both traditional and improved analysis of sperm quality, to define the critical steps of the process and identify possible chance to improve the efficiency of the freezing technique. The parameters are based on previous studies conducted at the PMA Center of the Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo in Pavia. The studies considered five different freezing protocols, selecting the best two, in terms of reduction in sperm motility and viability: M1 (Method 1): 30 min at + 4°C, 10 min on nitrogen vapors; M2: 2h at + 4 °C, 10 min on nitrogen vapors. Cryopreservation of human spermatozoa has been related to decreased motility associated with impaired velocity and with impaired viability of sperm pre-freeze and post-thaw, further investigated with analytical tests, using semen samples of five healthy and normospermic volunteers according to the ethical standards of the Hospital. Samples were frozen by two methods, thawed after 1 month and prepared for tests, to determine whether the cooling time to +4°C may affect the procedure. Non-routine analysis were performed using Comet Assay (to assess the degree of sperm DNA fragmentation), flow cytometry (to study the cell morphology by means of correlated scatter patterns as well as viability/membrane integrity by a couple of fluorescent probes such as PI/HO33342) and electron microscopy (to investigate ultrastructural cell details). The results confirmed the presence of a greater number of alterations in the frozen samples and no significant difference was appreciated between the effectiveness values obtained using the two different methods. It can be concluded that the two different steps of cooling at 4 °C do not cause significant morphological and functional alterations to the spermatozoa.
La crioconservazione dello sperma è stata riconosciuta come una strategia chiave nella preservazione della fertilità maschile. Nonostante ciò, i protocolli attuali di congelamento del liquido seminale attuati nei diversi laboratori, non sono ne ottimizzati ne standardizzati. In questo studio abbiamo comparato alcuni protocolli di crioconservazione di spermatozoi umani applicando sia metodi di analisi della qualità dello sperma tradizionali sia avanzati, al fine di definire i punti critici del processo e identificare possibili cambiamenti da apportare per migliorare l’efficienza delle tecniche di congelamento. I parametri si basano su studi precedenti condotti al centro di PMA della fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia. Per questi studi sono stati presi in considerazione cinque differenti protocolli di congelamento, selezionando i due migliori, in termini di riduzione della motilità e della vitalità degli spermatozoi: M1 (Metodo 1): 30 min a +4°C, 10 min in vapori di azoto; M2: 2 ore a 4°C, 10 min in vapori di azoto. La crioconservazione degli spermatozoi umani è stata correlata ad un decremento della motilità, associata ad una diminuita velocità e vitalità degli spermatozoi pre-congelati e scongelati, successivamente sono state svolte ricerche con test analitici, utilizzando i campioni di liquido seminale di cinque volontari sani e normospermici, in accordo con gli standard etici dell’ospedale. I campioni sono stati congelati con i due metodi, scongelati dopo un mese e preparati per i test, al fine di stabilire se il tempo di raffreddamento a +4°C potesse influenzare la procedura. Le analisi non routinarie sono state eseguite utilizzando il test Comet (per valutare il grado di frammentazione del DNA spermatico), la citometria a flusso (per studiare la morfologia cellulare tramite una media di patterns di dispersione correlati, e la vitalità/integrità di membrana con la coppia di sonde fluorescenti PI/HO33342) e la microscopia elettronica (per indagare dettagli ultrastrutturali delle cellule). I risultati hanno confermato la presenza di un gran numero di alterazioni nei campioni congelati ma non è stata apprezzata alcuna differenza significativa tra i valori di efficacia ottenuti impiegando i due diversi metodi. Si può concludere che i due diversi step di raffreddamento a +4°C non causano alterazioni morfologiche e funzionali significative negli spermatozoi.
STUDIO COMPARATIVO DI METODI PER LA CRIOCONSERVAZIONE DEGLI SPERMATOZOI UMANI: ANALISI ULTRASTRUTTURALE, MOLECOLARE E CITOMETRICA
CITTERIO, CHIARA
2014/2015
Abstract
Sperm cryopreservation has been recognized as a key strategy for preservation of fertility in males. Neverthless, current protocols of semen freezing are neither optimal nor standardized between different labs. In this study we compare some protocols of human spermatozoa cryopreservation applying both traditional and improved analysis of sperm quality, to define the critical steps of the process and identify possible chance to improve the efficiency of the freezing technique. The parameters are based on previous studies conducted at the PMA Center of the Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo in Pavia. The studies considered five different freezing protocols, selecting the best two, in terms of reduction in sperm motility and viability: M1 (Method 1): 30 min at + 4°C, 10 min on nitrogen vapors; M2: 2h at + 4 °C, 10 min on nitrogen vapors. Cryopreservation of human spermatozoa has been related to decreased motility associated with impaired velocity and with impaired viability of sperm pre-freeze and post-thaw, further investigated with analytical tests, using semen samples of five healthy and normospermic volunteers according to the ethical standards of the Hospital. Samples were frozen by two methods, thawed after 1 month and prepared for tests, to determine whether the cooling time to +4°C may affect the procedure. Non-routine analysis were performed using Comet Assay (to assess the degree of sperm DNA fragmentation), flow cytometry (to study the cell morphology by means of correlated scatter patterns as well as viability/membrane integrity by a couple of fluorescent probes such as PI/HO33342) and electron microscopy (to investigate ultrastructural cell details). The results confirmed the presence of a greater number of alterations in the frozen samples and no significant difference was appreciated between the effectiveness values obtained using the two different methods. It can be concluded that the two different steps of cooling at 4 °C do not cause significant morphological and functional alterations to the spermatozoa.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/23492