Sintesi, ottimizzazione e applicazione di PolyHIPEs come supporti innovativi per lo sviluppo di bioreattori

Negli ultimi decenni i supporti monolitici polimerici hanno riscosso particolare interesse in ambito biocromatografico. Tra i polimeri che possono essere utilizzati a questo scopo, quelli a base di acrilati sono stati oggetto di diversi studi per le loro interessanti capacità di flusso e per la possibilità di introdurre gruppi funzionali che possono essere sfruttati per l’immobilizzazione di macromolecole organiche. Oggetto di questo lavoro di tesi è stato la sintesi di nuovi polimeri a base di butilacrilato e glicidil metacrilato, monomeri che in seguito al processo di polimerizzazione danno luogo a polimeri definiti PolyHIPEs. Questi polimeri si ottengono partendo da un’emulsione costituita da una fase oleosa composta dai due monomeri, dal tensioattivo Synperonic e dal cross-linker TMPTA, in cui è dispersa una fase acquosa che rappresenta più del 75% dell’intera emulsione in cui è solubilizzato l’iniziatore radicalico KPS. Una volta ottenuta questa particolare emulsione definita HIPE (High Internal Phase Emulsion) si procede con la polimerizzazione aggiungendo il TEMED. L’obiettivo principale di questo progetto è stato quello di comprendere e ottimizzare le variabili che influenzano il processo di sintesi dei PolyHIPEs attraverso un disegno sperimentale (DoE) in modo da ottenere dei polimeri con determinate caratteristiche in termini di porosità, adatte ad un successivo processo di immobilizzazione enzimatica. Sono stati sintetizzati numerosi polimeri e caratterizzati. Ciò ha consentito di delineare un modello predittivo per la preparazione di supporti adatti allo sviluppo di bioreattori. Sono stati sintetizzati supporti monolitici all’interno di colonne cromatografiche (vetro e acciaio) e i supporti monolitici così creati sono stati collegati allo strumento HPLC e sottoposti a diversi cicli di lavaggio con solventi a polarità crescente. Sono stati creati dei bioreattori immobilizzando dapprima l’enzima Horse Radish Peroxidase (HRP) sul supporto contenuto in una colonna di vetro e, successivamente, la ω-transaminasi, sempre sfruttando il legame covalente che si instaura tra l’enzima e i gruppi epossidici liberi della fase stazionaria. La resa di immobilizzazione ricavata tramite un saggio spettrofotometrico per l’HRP è del 24.13 %, mentre per la ω-transaminasi del 44.25%. La scelta di immobilizzare l’enzima HRP è stata attuata in funzione del fatto che in letteratura è descritta una reazione standard catalizzata dall’enzima stesso, di semplice attuazione e che porta alla formazione di un prodotto che assorbe nel visibile. Attraverso questa reazione è stato dimostrato che l’enzima viene immobilizzato nella sua forma attiva ed è stato inoltre definito un profilo di cinetica enzimatica, secondo il quale la concentrazione di prodotto aumenta in modo direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato. Il passo successivo è stato quello di ottenere un bioreattore con la ω-transaminasi, grazie al quale ricavare come prodotto di reazione la 4-metossianfetamina, un intermedio di interesse farmaceutico. Partendo da 4-metossifenilacetone e D-Alanina in presenza di PLP come cofattore enzimatico, si ottiene una percentuale di conversione alle 24 ore del substrato chetonico in prodotto del 10,11% . In conclusione, dai dati sperimentali ottenuti si evince che i PolyHIPEs risultano essere dei materiali promettenti per lo sviluppo di bioreattori.