Terapia genica applicata a un modello paziente-specifico di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica autosomica recessiva

La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica di tipo 2 (CPVT2) è una malattia ereditaria autosomica recessiva, causata da mutazioni a carico del gene codificante la Calsequestrina 2 (CASQ2) che determinano l’alterazione dell’omeostasi del calcio intracellulare. Tale patologia è caratterizzata da tachicardia ventricolare bidirezionale o polimorfa indotta da stimolo adrenergico che può portare a sincope e a morte improvvisa in giovane età. In precedenti studi sperimentali abbiamo dimostrato che la somministrazione del gene murino CASQ2 “Wild Type” mediante infezione virale previene lo sviluppo degli eventi aritmici in un modello murino geneticamente modificato (CASQ2-R33Q) che riproduce fedelmente il fenotipo CPVT umano. Alla luce di questi dati abbiamo generato un modello umano di CPVT2 attraverso il differenziamento in cardiomiociti di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-CMs) derivate da paziente, per estendere il nostro studio preclinico ad un modello sperimentale paziente-specifico, avente il gene CASQ2 mutato in CASQ2-G112+5X. Tale mutazione determina la delezione di 16 nucleotidi in posizione 339-354 nell’esone 3 del gene hCASQ2, generando così un codone di stop prematuro. La Calsequestrina 2 rimane così priva della maggior parte dei residui aminoacidici a livello della porzione terminale (-COOH), regione implicata nel legame ionico e nel processo di dimerizzazione, necessaria per la regolazione del calcio nel reticolo sarcoplasmatico. Le iPSCs sono state generate a partire da fibroblasti isolati da biopsia cutanea del probando, portatore della mutazione CASQ2-G112+5X in omozigosi (HO), e del padre, portatore della stessa mutazione in eterozigosi (HE), mediante l’infezione con il virus Sendai che ha permesso l’espressione dei quattro fattori trascrizionali di Yamanaka (OCT-4, Sox2, Klf4 e c-MYC). In seguito alla caratterizzazione molecolare di tali linee cellulari che ha dimostrato il loro stato di pluripotenza, le iPSCs sono state differenziate in cardiomiociti (iPSC-CMs) mediante rapida attivazione e successiva lenta inibizione della via di Wnt. iPSC-CMs, dopo aver verificato che fossero in grado di ricapitolare il fenotipo clinico, sono stati infettati con il vettore virale Adeno-Associato di sierotipo 9 (AAV9) da noi disegnato e prodotto, codificante per il gene umano CASQ2 “Wild Type” (AAV9_hCASQ2_T2A_RFP), al fine di verificare se la somministrazione di Calsequestrina esogena potesse correggere il fenotipo aritmogeno in un modello sperimentale di malattia esattamente corrispondente alla patologia umana. Trenta giorni dopo l’infezione, i cardiomiociti derivanti dalle iPSC paziente-specifico sono stati processati per le analisi molecolari che hanno permesso di valutare l’espressione sia del trascritto che della proteina Casq2. I risultati hanno mostrano che la somministrazione di Casq2 permette il ripristino dei livelli fisiologici di espressione della proteina e una netta diminuzione, sino alla scomparsa, delle alterazioni elettrofisiologiche e degli eventi aritmici. La normalizzazione dei potenziali d’azione, della regolazione del Ca2+ intracellulare e il ripristino della proteomica cellulare ha dimostrato la specificità del sistema nel recupero fisiologico della proteina e del calcio intracellulare, la capacità di riparare il difetto funzionale causativo della patologia e l’efficacia del trasferimento genico mediato dal vettore virale AAV9 in un sistema modello cardiaco-specifico umano. Questo rappresenta un ulteriore passo in avanti verso l’applicazione clinica della terapia genica per il trattamento della CPVT2.