Mammalian terminal deoxyribonucleotidyltransferase (TdT) catalyzes the non–template-directed polymerization of deoxyribonucleoside triphosphates and has a key role in the V(D)J recombination process, that leads to the rearrangement of the primary repertoires of antibody genes and T-cell receptor genes in B and T lymphocytes. Clinical studies have showed a crucial role of TdT in cancer development, being expressed to very high levels in B and T cell Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and Acute Myelocitic Leukemia (AML). DNA polymerase Lambda, the progenitor of repair DNA polymerases family that includes also TDT and DNA polymerase Beta, is able to synthesize DNA both in a template dependent (DNA polymerase) and, like TDT, in a template-independent (terminal deoxyribonucleotidyltransferase) fashion. This activity has been suggested to have a role in NHEJ repair pathway of DNA double strand breaks. In this work, we report the evaluation of novel Non-nucleoside analogs as TdT, pol Lambda and pol Beta inhibitors tested in in vitro assays. Such investigation has been conducted using both Mg2+ and Mn2+ cofactor, revealing a strong preference of the tested compounds for the inhibition of Mg 2+ mediated TdT activity. Lastly, we report the setup of the RealTime-Glo MT CellViability Assay, that will be used to test the more promising compounds on TdT-positive ALL cell lines.
La deossiribonucleotidiltrasferasi terminale (TdT) nei mammiferi catalizza la polimerizzazione stampo-indipendente di deossiribonucleotidi trifosfato ed ha un ruolo chiave nel processo di ricombinazione V(D)J, che provoca il riarrangiamento dei repertoire primari dei geni codificanti per anticorpi e recettori di cellule T rispettivamente nei linfociti B e T. Studi clinici hanno mostrato il ruolo cruciale della TdT nell’insorgenza del cancro, in quanto è espressa ad alti livelli nella Leucemia Linfoblastica Acuta nelle cellule B e T e nella Leucemia Mielocitica Acuta. La DNA Polimerasi Lambda, enzima progenitore della famiglia delle DNA polimerasi riparatrici, che include anche TdT e la DNA Polimerasi Beta, è in grado di sintetizzare DNA sia in modo stampo-dipendente (DNA polimerasi) sia in modo stampo-indipendente (deossiribonucleotidiltransferasi terminale). Si pensa che quest'attività possa avere un ruolo nel meccanismo di riparazione Non-Homologous End Joining delle rotture di DNA a doppio filamento. In questa tesi, riportiamo la valutazione di nuovi analoghi non nucleosidici come inibitori di Terminal Transferasi, pol Lambda e pol Beta, testati in saggi in vitro. Tale ricerca è stata condotta utilizzando come cofattori sia Mg2+sia Mn2+ ed ha rivelato una forte preferenza da parte dei composti testati per l’inibizione dell’attività di TdT mediata da Mg2+. Infine riportiamo lo sviluppo del saggio di vitalità cellulare RealTime-Glo, che verrà utilizzato per testare alcuni dei composti sopracitati più promettenti in linee cellulari ALL TdT-positive.
Valutazione di nuovi analoghi non nucleosidici come inibitori della DeossinucleotidilTrasferasi Terminale umana per il trattamento della Leucemia Linfoblastica Acuta
GARIBALDI, NADIA
2016/2017
Abstract
Mammalian terminal deoxyribonucleotidyltransferase (TdT) catalyzes the non–template-directed polymerization of deoxyribonucleoside triphosphates and has a key role in the V(D)J recombination process, that leads to the rearrangement of the primary repertoires of antibody genes and T-cell receptor genes in B and T lymphocytes. Clinical studies have showed a crucial role of TdT in cancer development, being expressed to very high levels in B and T cell Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and Acute Myelocitic Leukemia (AML). DNA polymerase Lambda, the progenitor of repair DNA polymerases family that includes also TDT and DNA polymerase Beta, is able to synthesize DNA both in a template dependent (DNA polymerase) and, like TDT, in a template-independent (terminal deoxyribonucleotidyltransferase) fashion. This activity has been suggested to have a role in NHEJ repair pathway of DNA double strand breaks. In this work, we report the evaluation of novel Non-nucleoside analogs as TdT, pol Lambda and pol Beta inhibitors tested in in vitro assays. Such investigation has been conducted using both Mg2+ and Mn2+ cofactor, revealing a strong preference of the tested compounds for the inhibition of Mg 2+ mediated TdT activity. Lastly, we report the setup of the RealTime-Glo MT CellViability Assay, that will be used to test the more promising compounds on TdT-positive ALL cell lines.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/23988