Un’alterata funzionalità cellulare dovuta all’accumulo intracellulare del collagene mutato nei fibroblasti di pazienti affetti da oi rappresenta un promettente target terapeutico.

Osteogenesis Imperfecta (OI), also known as “brittle bone disease”, is a heritable genetic disease, with dominant and recessive transmission, characterized by bone fragility and skeletal deformity. The majority of dominant OI cases is caused by mutations in COL1A1 or COL1A2 genes, encoding for the α1 and α2 chains of type I collagen, and it is responsible for the deposition of an altered extracellular matrix (ECM). The molecular basis of this disorder has conventionally been attributed to the presence of an abnormal ECM and impairment of its structural integrity. It is anyway known that mutated proteins are intracellular retained and accumulated in the endoplasmic reticulum (ER) and this can cause cellular stress. Here we propose that the OI outcome may be significantly modulated by cellular stress and malfunction and thus that cellular response to collagen retention, together with the altered matrix, is a key component in Osteogenesis Imperfecta pathogenesis. We demonstrated the presence of collagen overmodifications and intracellular accumulation in several OI patients fibroblasts carrying different mutations in COL1A1 or COL1A2 genes and we investigated the three intracellular pathways normally activated by the cells in response to the cellular stress: unfolded protein response (UPR), autophagy and apoptosis. Activation of the UPR as well as of the apoptotic pathway was a common feature of almost all the cell lines regardless the gene involved and the type of mutation. The activation of autophagy instead was a prerogative for COL1A1 mutated cells. Interestingly, in α1-G667R(II) and α1-G667R(III) patient cells, carrying the same mutation but associated to a lethal and a surviving phenotype respectively, a different cellular response was detected. Western blot and FACS analysis demonstrated that in the G667R(III) cells the expression of autophagic markers was higher, whereas in the cell G667R(II) the apoptotic response was predominant. We also attemped to ameliorate the cell ability to cope with mutant collagen retention in our patients fibroblasts by culturing them in presence of two already FDA approved chemical chaperone, 4-phenylbutyric acid (4-PBA) and tauroursodeoxycholic acid, or with an autophagy inducer, digoxin or with the cofactor of collagen synthesis, ascorbic acid. The treatments with 4-PBA and ascorbic acid provided promising results since both drugs decreased the activation of the UPR stress sensor and the expression of apoptotic markers. Our research has allowed the identification and in vitro validation of new promising targets for the treatment of OI.

L’Osteogenesis Imperfecta (OI) è un malattia genetica ereditaria, a trasmissione autosomica sia dominante che recessiva, caratterizzata da fragilità ossea e deformità dello scheletro. Nella maggior parte dei casi le forme dominanti di OI sono causate da mutazioni nei geni COL1A1 o COL1A2, che codificano per le catene α1 e α2 del collagene di tipo I. Queste mutazioni sono responsabili del deposito di un’alterata matrice extracellulare e dell’accumulo intracellulare di proteine mutate causando stress alla cellula. Le basi molecolari della patologia sono tradizionalmente attribuite alla presenza di una matrice extracellulare alterata. E’ stato tuttavia recentemente osservato che la presenza di proteine mutate e trattenute all’interno del reticolo endoplasmatico causa uno stress cellulare in numerose patologie. Lo scopo della tesi è stato quindi quello di dimostrare che il fenotipo dell’OI è modulato dallo stress cellulare e che la risposta cellulare alla ritenzione del collagene, insieme alla presenza di una matrice alterata, è una componente chiave nella patogenesi dell’OI. Durante il mio tirocinio di tesi sono state analizzate linee di fibroblasti di pazienti affetti da OI con diverse mutazioni nei geni COL1A1 e COL1A2 ed è stata dimostrata la presenza di una overmodificazione nelle catene di collagene mutato e di un suo accumulo a livello intracellulare. Lo stress cellulare è stato studiato attraverso l’analisi di tre pathways: unfolded protein response (UPR), autofagia ed apoptosi. L’attivazione dell’UPR e dell’apoptosi è stata riscontrata in tutte le linee cellulari analizzate. L’attivazione dell’autofagia, invece, era peculiare delle cellule con mutazioni che interessano il gene COL1A. L’analisi dei pathways nei fibroblasti di pazienti con la stessa mutazione ma con fenotipo differente, α1-G667R(II) letale e α1-G667R(III) non- letale, ha evidenziato una diversa risposta a livello cellulare. In particolare, in α1-G667R(III) è stata riscontrata un’elevata espressione dei markers autofagici mentre in α1-G667R(II) risulta upregolata l’apoptosi. Al fine di migliorare la capacità della cellula di gestire la ritenzione intracellulare del collagene mutato, i fibroblasti sono stati coltivati in presenza di due chaperoni molecolari, approvati da FDA, 4-phenylbutyric acid (4-PBA) e tauroursodeoxycholic acid, o con un induttore dell’autofagia, la digossina o con l’acido ascorbico che è un cofattore della sintesi del collagene. Il trattamento con il 4-PBA e l’acido ascorbico ha dato buoni risultati, in quanto entrambi i trattamenti diminuivano l’attivazione dei sensori dello stress del pathway UPR e l’espressione dei markers dell’apoptosi. La nostra ricerca ha identificato quindi in vitro nuovi promettenti targets per il trattamento dell’OI.