Il glutammato evoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2+ e rilascio di monossido d’azoto in una linea cellulare endoteliale del microcircolo cerebrale umano

Neurovascular coupling (NVC) is the mechanism whereby an increase in neuronal activity causes an increase in local cerebral blood flow (CBF) to ensure local supply of oxygen and nutrients to the activated areas. The excitatory neurotransmitter glutamate gates post-synaptic N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors to mediate extracellular Ca2+ entry and stimulate neuronal nitric oxide (NO) synthase (nNOS) to release NO, thereby triggering NVC. Recent work suggested that endothelial Ca2+ signals could underpin NVC by recruiting the endothelial NO synthase (eNOS). For instance, acetylcholine induced intracellular Ca2+ signals followed by NO release by activating muscarinic 5 receptors in hCMEC/D3 cells, a widely employed model of human brain microvascular endothelial cells. Herein, we sought to assess whether also glutamate elicits metabotropic Ca2+ signals and NO release in hCMEC/D3 cells. Glutamate induced a dose-dependent increase in intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) that was blocked by α-methyl-4-carboxyphenylglycine and phenocopied by trans-1-amino-1,3-cyclopentanedicarboxylic acid, which, respectively, block and activate Group 1 metabotropic glutamate receptors (mGluRs). Accordingly, and hCMEC/D3 expressed both mGluR1 and mGluR5 and the Ca2+ response to glutamate was inhibited by their pharmacological blockade with, respectively, CPCCOEt and MTEP hydrochloride. The Ca2+ response to glutamate was initiated by endogenous Ca2+ release from the endoplasmic reticulum (ER) and endolysosomal (EL) Ca2+ store through inositol-1,4,5-trisphosphate receptors and two-pore channels, respectively, and sustained by store-operated Ca2+ entry (SOCE). Additionally, glutamate induced robust NO release that was suppressed by pharmacological blockade of the accompanying increase in [Ca2+]i. These data demonstrate for the first time that glutamate may induce metabotropic Ca2+ signals in human brain microvascular endothelial cells. The Ca2+ response to glutamate is likely to support NVC during neuronal activity, thereby reinforcing the emerging role of brain microvascular endothelial cells in the regulation of CBF.

L'accoppiamento neurovascolare (NVC) è il meccanismo mediante il quale un aumento dell'attività neurone causa un aumento locale del flusso sanguigno cerebrale (CBF) per garantire il supporto locale di ossigeno e nutrienti nell'area attivata. Il neurotrasmettitore glutammato lega i recettori post sinaptici N-metil-D-aspartato (NMDA) e media l'entrata di Ca2+ extracellulare e stimola la monossido di azoto sintasi neuronale (nNOS) a produrre NO, guidando così il NVC. Lavori recenti suggeriscono che i segnali di Ca2+ endoteliali possono sostenere il NVC reclutando la NOS endoteliale (eNOS). Per esempio, l'acetilcolina induce segnali di Ca2+ intracellulari e conseguente rilascio di NO attivando i recettori muscarinici 5 nelle cellule hCMEC/D3, un modello di cellule endoteliali umane del microcircolo cerebrale ampiamente utilizzato. In questo lavoro di Tesi abbiamo cercato di valutare se anche il glutammato induce segnali di Ca2+, attivando i recettori metabotropici, e il conseguente rilascio di NO nelle cellule hCMEC/D3. Il glutammato induce un aumento della concentrazione di Ca2+ intracellulare ([Ca2+]i) in maniera dose-dipendente, il quale è bloccato da α-metil-4-carbossifenilglicole (MCPG), un bloccante selettivo dei recettori metabotropici glutamatergici (mGluRs) del Gruppo 1, ed è mimato dall'acido trans-1-amino-1,3-ciclopentanedicarbossilico, un agonista dei mGluR del Gruppo 1. Coerentemente le cellule hCMEC/D3 esprimono sia mGluR1 che mGluR5, e i segnali di Ca2+ indotti dal glutammato sono inibiti dal loro blocco farmacologico con, rispettivamente, CPCCOEt e MTEP cloridrato. La risposta di Ca2+ è iniziata dal rilascio di Ca2+ endogeno dal reticolo endoplasmatico (RE) e dagli store endolisosomali (EL) mediante, rispettivamente, i recettori per l’inositolo-1,4,5-trifosfato e i canali a due pori, ed è sostenuta dall’entrata di Ca2+ operata dagli store intracellulari (SOCE). In aggiunta, il glutammato induce un robusto rilascio di NO che viene soppresso dal bloccaggio farmacologico dell’accoppiato aumento della [Ca2+]i. Questi dati dimostrano per la prima volta che il glutammato può indurre dei segnali di Ca2+ di origine metabotropica nelle cellule endoteliali del microcircolo cerebrale. La risposta di Ca2+ al glutammato probabilmente supporta il NVC durante l’attività neuronale, rinforzando quindi il ruolo emergente delle cellule endoteliali del microcircolo cerebrale nella regolazione del CBF.