Glutamine is an essential amino acid for cancer cells, working both as a carbon and as a nitrogen source that the cells utilize to fulfil the high biosynthetic and bioenergetic demands accompanied to the high proliferation rate. Previous studies performed in our laboratory taking advantage of the cen3tel telomerase-transformed cellular system, demonstrated that glutamine withdrawal induced cell death and c-Myc translation from a cryptic start site; asparagine supplementation recovered both these processes. Therefore, in this thesis, we further studied the effects of asparagine supplementation and the possible mechanisms trough which it sustained cellular viability and canonical c-Myc translation. For this aim, we analyzed the level of c-MYC transcript in cells grown in different nutrient conditions. Then, we tested whether c-Myc cryptic translation could be due to a reduced activity of mTORC1, caused by glutamine starvation, by utilizing rapamycin, an mTORC1 inhibitor and we analyzed c-Myc levels by western blotting. Next, we analyzed the global level of cellular translation in absence of glutamine and in cells starved for glutamine and fed with asparagine, by performing a puromycin incorporation assay; to understand if there was a direct relationship between the recovery of cellular proliferation in the presence of asparagine and protein translation efficiency, since asparagine is mainly used for protein synthesis. Subsequently, we studied the role of GLUL, the enzyme which synthesizes glutamine de novo, to understand if differential levels of this enzyme could account for cell survival and proliferation when asparagine was supplied to glutamine-starved cells. To do this, we first analyzed the level of GLUL in different nutrient conditions and we analyzed the effects of its inhibition on cellular viability, by utilizing L-methionine sulfoxide (MSO) GLUL inhibitor. Finally, we investigated the possible relationship between c-Myc and GLUL, both at the transcriptional and at the translational level, taking advantage of the c-Myc inhibitor 10074-G5 and analyzing GLUL expression in the different nutrient conditions.
La glutammina è un amino acido essenziale per le cellule tumorali, essendo unimportante risorsa di carbonio e azoto che queste cellule utilizzano per la sintesi di macromolecole necessarie a sostenere un alto tasso di proliferazione. Precedenti studi condotti nel nostro laboratorio, sfruttando il sistema di cellule tumorali cen3tel, trasformate tramite telomerasi, hanno dimostrato che lassenza di glutammina induce la morte cellulare e la traduzione di c-Myc, protooncogene e importante fattore di trascrizione, da un sito di criptico di inizio della traduzione. In questo contesto, l'integrazione di asparagina si è dimostrata necessaria per il recupero di entrambi gli eventi sopracitati. Pertanto, in questa tesi, abbiamo investigato ulteriormente gli effetti dellasparagina in assenza di glutammina e i possibili meccanismi attraverso i quali lasparagina è in grado di sostenuto la vitalità cellulare e la traduzione di c-Myc dal sito di inizio canonico. A tale scopo, abbiamo analizzato il livello di trascritto c-MYC in cellule cresciute in diverse condizioni nutritive. In seguito, essendo la glutammina un amino acido capace di stimolare mTORC1, abbiamo testato se la traduzione di c-Myc dal sito criptico potesse essere dovuta ad una ridotta attività di mTORC1, causata dellassenza di glutammina. Per fare questo, abbiamo utilizzato la rapamicina, un inibitore di mTORC1 ed abbiamo analizzato i livelli di c-Myc attraverso la tecnica del western blotting. Successivamente, essendo lasparagina utilizzata maggiormente per la sintesi proteica, abbiamo effettuato un test di incorporazione della puromicina, al fine di analizzare i livelli di sintesi proteica in cellule cresciute in assenza di glutammina o in assenza di glutammina ma in presenza di asparagina. Questo test è stato effettuato per capire se ci fosse una relazione diretta tra il recupero della proliferazione cellulare, osservato in cellule cresciute in presenza di asparagina, e l'efficienza della sintesi proteica condizioni. Successivamente, abbiamo studiato il ruolo di GLUL, l'enzima responsabile per la biosintesi della glutammina, per capire se differenti livelli di questo enzima potessero spiegare la sopravvivenza e la proliferazione cellulare in presenza di asparagina. Preliminarmente, abbiamo analizzato il livello di GLUL in diverse condizioni nutritive ed in seguito, abbiamo analizzato gli effetti della sua inibizione sulla vitalità cellulare, utilizzando lMSO,un inibitore di GLUL. Infine, abbiamo ricercato una possibile relazione tra c-Myc e GLUL, sia a livello trascrizionale che a livello traduzionale, utilizzano l'inibitore di c-Myc, 10074-G5, e analizzando l'espressione di GLUL nelle diverse condizioni nutritive.
ASPARAGINE SUSTAINS CELLULAR VIABILITY AND INDUCES C-MYC AND GLUTAMINE SYNTHETASE EXPRESSION IN GLUTAMINE-STARVED HUMAN TRANSFORMED FIBROBLASTS.
PERINI, CECILIA
2018/2019
Abstract
Glutamine is an essential amino acid for cancer cells, working both as a carbon and as a nitrogen source that the cells utilize to fulfil the high biosynthetic and bioenergetic demands accompanied to the high proliferation rate. Previous studies performed in our laboratory taking advantage of the cen3tel telomerase-transformed cellular system, demonstrated that glutamine withdrawal induced cell death and c-Myc translation from a cryptic start site; asparagine supplementation recovered both these processes. Therefore, in this thesis, we further studied the effects of asparagine supplementation and the possible mechanisms trough which it sustained cellular viability and canonical c-Myc translation. For this aim, we analyzed the level of c-MYC transcript in cells grown in different nutrient conditions. Then, we tested whether c-Myc cryptic translation could be due to a reduced activity of mTORC1, caused by glutamine starvation, by utilizing rapamycin, an mTORC1 inhibitor and we analyzed c-Myc levels by western blotting. Next, we analyzed the global level of cellular translation in absence of glutamine and in cells starved for glutamine and fed with asparagine, by performing a puromycin incorporation assay; to understand if there was a direct relationship between the recovery of cellular proliferation in the presence of asparagine and protein translation efficiency, since asparagine is mainly used for protein synthesis. Subsequently, we studied the role of GLUL, the enzyme which synthesizes glutamine de novo, to understand if differential levels of this enzyme could account for cell survival and proliferation when asparagine was supplied to glutamine-starved cells. To do this, we first analyzed the level of GLUL in different nutrient conditions and we analyzed the effects of its inhibition on cellular viability, by utilizing L-methionine sulfoxide (MSO) GLUL inhibitor. Finally, we investigated the possible relationship between c-Myc and GLUL, both at the transcriptional and at the translational level, taking advantage of the c-Myc inhibitor 10074-G5 and analyzing GLUL expression in the different nutrient conditions.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/24592