Sindrome di Aicardi-Goutières e Lupus Eritematoso Sistemico: caratterizzazione mediante Next Generation Sequencing (NGS)

The Aicardi-Goutières Syndrome (AGS) is a rare genetically determined encephalopathy with onset in the first year of life, which is mainly characterized by basal ganglia calcification, white matter alteration, cerebral atrophy, cerebrospinal fluid (CSF) chronic lymphocytosis and liquor increased levels of interferon-alpha (IFN-α). To date, mutations in 7 genes TREX1, RNASEH2A, RNASEH2B, RNASEH2C, SAMDH1, ADAR1 and IFIH1 have been found to be responsible for the majority of AGS cases. Moreover, recent studies correlated, from a genetic and pathogenic point of view, the AGS onset with some autoimmune diseases, such as the interferonopathies, where interferon plays a crucial role. Among them, Systemic Lupus Erythematosus (SLE), is characterized by increased levels of IFN-α and heterogeneous phenotype. To date, mutations in TREX1, SAMHD1 and IFIH1 genes have been described in SLE patients. Thus, the present work aims to the optimization of a genetic platform to study and characterize AGS and SLE patients, evaluating the possible correlations between these two pathologies. DNA from 60 AGS patients and 51 SLE patients was processed following the e-TruSeq Custom Amplicon protocol (Illumina). The AGS platform included all the 7 target genes. The identified variants were confirmed by Sanger sequencing. The insertion/deletion analysis was performed using the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, with the SALSA MLPA probemix P388-A2 AGS kit. Specific prediction software were used to determine the possible pathogenic significance of the not previously described variants. To evaluate the interferon signature, RNA was extracted from the peripheral blood of 12 AGS patients and 19 controls and the expression of interferon-inducible genes, such as SIGLEC1, IFI44, IFI27, RSAD2, ISG15, IFIT1 was analyzed by Real Time PCR. The genetic analysis of 51 SLE patients revealed the presence of two non-pathogenic variants: - 4 patients with an heterozygous substitution in the RNASEH2A gene, c.605T>C, p.L202S. - 1 patient with a benign heterozygous variant in the SAMHD1gene, c.104 G>T, p.G35V. The NGS genetic analysis of the 60 AGS patients identified several pathogenic mutations in the 7 target genes and allowed the characterization of 33 AGS subjects (55% of the total patients). In particular, the 6% of patients has been found mutated in the TRX1 gene, the 3% in the RNASEH2A gene, the 67% in the RNEASEH2B gene, the 3% in the RNASEH2C gene, the 3% in the SAMHD1 gene, the 9% in the ADAR1 gene and the 9% in the IFIH1 gene. Among the 12 analyzed patients for the interferon signature, 11 showed a positive test, while only one patients with a mutated RNASEH2B resulted negative. These observations could be associated to the variability of the expression of the interferon-inducible genes, although these data are consistent with evidences present in the literature, which underlie a test negativity in the 30% of patients with a mutation of the RNASEH2B gene. The optimization of a platform for the analysis of the 7 disease genes has proved to be an excellent diagnostic tool for patients suffering from AGS. The data allowed to characterize 33 of the 60 AGS patients, without revealing pathogenic mutations in SLE patients. Both patients populations will be expanded, including in the analysis several genes also involved in other autoimmune diseases.

La sindrome di Aicardi-Goutières (AGS) è un’encefalopatia progressiva ereditaria con esordio nel primo anno di vita, caratterizzata da microcefalia acquisita, calcificazioni dei gangli della base, anomalie della sostanza bianca, linfocitosi cronica e aumentati livelli di interferone-alpha (IFN-α) nel liquor. Ad oggi, sono stati identificati 7 geni responsabili della maggior parte dei casi: TREX1, RNASEH2B, RNASEH2C e RNASEH2A, SAMHD1, ADAR1 e IFIH1, unico gene a trasmissione autosomica dominante. Recenti studi sembrerebbero correlare, da un punto di vista genetico e patogenetico, l’AGS ed alcune malattie autoimmuni, le interferonopatie, in cui l’interferone gioca un ruolo cruciale. In questo gruppo rientra il Lupus Eritematoso Sistemico (LES), caratterizzato da aumentati livelli di IFN-α e fenotipo eterogeneo. Ad oggi, sono state descritte mutazioni in TREX1, SAMHD1 e IFIH1, in pazienti affetti da LES. Lo scopo del presente lavoro è la messa a punto di una piattaforma genica per lo studio e la caratterizzazione di pazienti affetti da AGS e la ricerca di un’associazione genetica tra questa sindrome e il LES. Il DNA di 60 pazienti AGS e di 51 pazienti LES è stato processato seguendo il protocollo e-TruSeq Custom Amplicon protocol (Illumina). La piattaforma AGS comprende tutti i 7 geni target. Le conferme delle varianti trovate sono state ottenute mediante sequenziamento Sanger. L’analisi di inserzione/delezione è stata condotta mediante Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, utilizzando il kit SALSA MLPA probemix P388-A2 AGS. Le varianti riscontrate ma non presenti sui database consultabili, sono state valutate utilizzando i software di predizione specifici. Per la valutazione della firma dell’interferone è stato estratto l’RNA dal campione di sangue periferico di 12 pazienti AGS e 19 controlli, analizzando, mediante Real Time PCR, l’espressione dei geni interferone-inducibili SIGLEC1, IFI44, IFI27, RSAD2, ISG15, IFIT1. L’analisi genetica nei 51 pazienti affetti da LES ha evidenziato la presenza di due varianti non patogenetiche: - una sostituzione in eterozigosi nel gene RNASEH2A, c.605T>C, p.L202S in 4 pazienti LES. - una variante benigna in eterozigosi nel gene SAMHD1, c.104 G>T, p.G35V in un paziente LES. L’analisi NGS dei 60 pazienti AGS ci ha permesso di identificare differenti mutazioni patogenetiche a carico dei 7 geni malattia e caratterizzare geneticamente 33 pazienti (55% dei pazienti). In particolare, il 6% dei pazienti è risultato mutato in TREX1, il 3% in RNASEH2A, il 67% in RNASEH2B, il 3% in RNASEH2C, il 3% in SAMHD1, il 9% in ADAR1 e il 9% in IFIH1. Dei 12 pazienti analizzati per la firma dell’interferone, 11 si sono rivelati positivi al test, mentre un paziente, RNASEH2B mutato, è risultato negativo. Questa evidenza può essere associata ad una variabilità nell’espressione dei geni interferone-inducibili, tuttavia il dato risulta essere in linea con dati presenti in letteratura che evidenziano negatività al test nel 30% dei pazienti mutati nel gene RNASEH2B. La messa a punto di una piattaforma genica per i 7 geni malattia si è rivelata quindi un ottimo strumento diagnostico per i pazienti affetti da AGS. I dati hanno permesso di caratterizzare 33 dei 60 pazienti affetti da AGS e non sono state riscontrate mutazioni patogenetiche in pazienti affetti da LES. L’obiettivo futuro sarà quello di ampliare la casistica per entrambe le patologie, estendendo l’analisi a geni coinvolti anche in altre patologie autoimmuni.