DESIGN OF EXPERIMENTS APPLIED TO THE OPTIMIZATION OF BIOCATALYZED SYNTHESES OF PHARMACEUTICAL INTERMEDIATES. A KEY STUDY INVOLVING REDOX ENZYMES

Each synthetic process requires appropriate selection of operating conditions and, possibly, optimization. A heuristic approach is frequently used to this aim, particularly at the first stage of the study; however, modeling of reactions is definitely a more precise, informative and reliable tool for the determination of feasible experimental conditions and for optimization, thereof. Quality by Design (QbD) is, indeed, a scientific approach that formalizes product design, automates manual testing, and streamlines troubleshooting by a systematic approach. QbD and, in particular, the use of Design of Experiment (DoE), a statistical approach to the experimental work, allows to achieve a thorough understanding of the variables as a whole affecting the components and processes involved in manufacturing a specific product. Aim of this work was to identify the “ideal” experimental conditions for a biocatalytic reaction through a chemometric approach. The biotransformation under investigation involved the stereoselective reduction of methyl-4-(2-methyl-1,3-dioxolan-2-yl)-3-oxobutanoate (1) to methyl-(3R)-3-hydroxy-4-(2-methyl-1,3-dioxolan-2-yl)-3-butanoate (2); the latter compound is a key intermediate for the synthesis of rosuvastatin, a competitive inhibitor of the enzyme beta-hydroxy-methyl-beta-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase, used for the treatment of dyslipidemia, hypercholesterolemia, hypertrigliceridemia. Two parallel redox reactions catalyzed by a ketoreductase (KRED-130) acting on the main substrate and by a glucose dehydrogenase (CDX-901) for the cofactor regeneration (NADPH), respectively, were considered. Owing to the substrate selectivity showed by KRED-130 and CDX-901, the reaction was performed through a one-pot mode. A series of spectrophotometric analyses were carried out to assess KRED-130 kinetics, stability and activity with the goal to select maximum and minimum interval levels of the DoE. A two-level factorial design was carried out by considering five factors: temperature, pH, dilution, ionic strength, cofactor concentration. Reaction monitoring and characterization of the substrate and the final product were carried out by 1H NMR and 1H-1H NMR spectroscopy (COSY), HPLC, mass spectrometry analyses and UV-Visible spectroscopy. A standard extractive work-up was used to isolate the final product. Its purity was sufficient to determine HPLC relative response factor versus the substrate. The highest percentage conversion was obtained at the conditions defined by the central points within the intervals studied, according to pre-DoE studies. A significant effect of the temperature emerged on the response as well as minor effects due to the ionic strength interactions with pH and dilution.

Ogni processo sintetico richiede un’accurata selezione delle condizioni operative e, successivamente, la loro ottimizzazione. Solitamente, nella prime fasi di lavoro, un approccio euristico consente di identificare le variabili critiche di processo; in un secondo tempo, il metodo dovrà essere controllato e convalidato per via rigorosa. Quality by Design (QbD) è un approccio sistematico che formalizza la progettazione della qualità, basandosi sull’assunto che la maggior parte delle criticità nascono da un’errata pianificazione sperimentale. Un utile strumento statistico in grado di stimare, con un definito grado di significatività, l’effetto dei singoli fattori e delle loro interazioni sulla risposta all’interno dell’intervallo dei livelli considerato, è il Design of Experiment (DoE). Questo strumento chemometrico è stato utilizzato in questa tesi allo scopo di identificare le condizioni di reazione in grado di fornire la più alta percentuale di conversione di metil-4-(2-metil-1,3-diossolan-2-il)-3-oxobutanoato (1) in metil-(3R)-3-idrossi-4-(2 metil-1,3-diossolan-2-il)-3-butanoato (2). Quest’ultimo rappresenta un intermedio chiave per la sintesi di rosuvastatina, un inibitore competitivo dell'enzima beta-idrossi-metil-beta-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reduttasi, utilizzato nel trattamento delle dislipidemie. La reazione in esame prevede la riduzione stereoselettiva di (1) catalizzata da una chetoreduttasi (KRED-130) in presenza di un sistema di rigenerazione del cofattore (NADPH) costituito da una glucosio deidrogenasi (CDX-901) in presenza di glucosio. Un’attenta valutazione delle criticità del sistema biocatalitico ha permesso di identificare cinque fattori rilevanti: temperatura, pH, diluizione, forza ionica e concentrazione del cofattore. Studi spettrofotometrici preliminari hanno consentito di determinare la cinetica, la stabilità termica e l’attività enzimatica di KRED-130 e hanno guidato la scelta dei livelli minimo e massimo dell’intervallo di ogni fattore. Sulla base di tali considerazioni è stato progettato un modello fattoriale frazionario a due livelli. Il monitoraggio della reazione è stato eseguito mediante HPLC e la caratterizzazione di substrato (1) e prodotto (2) è stata effettuata mediante HPLC, spettroscopia 1H NMR e 1H-1H NMR, spettrometria di massa e spettroscopia UV-Visibile. Il prodotto finale è stato isolato mediante procedure standard di estrazione, risultando sufficientemente puro da poter essere utilizzato tal quale per la determinazione del fattore di risposta relativo dello stesso (2) rispetto al substrato (1). In base al disegno sperimentale utilizzato, all’interno degli intervalli di livello dei fattori studiati, i punti centrali corrispondono alle condizioni sperimentali in grado di fornire la più alta conversione percentuale, in accordo con gli studi pre-DoE. L’analisi statistica del modello dimostra la presenza di un effetto significativo della temperatura e di effetti minori dovuti alle interazioni della forza ionica con i fattori pH e diluizione.