Introduction: The characteristic of Parkinson's disease (PD) is the progressive degeneration of dopaminergic neurons of Substantia Nigra Pars Compacta (SNc) with consequent dopamine depletion of the striatum, which receives the SNc projections. The ethiopathogenesis of PD is very complex and multifactorial; the neuroinflammation is certainly involved and contributes to the neuronal damage's progression. Epidemiological data suggest a sexual dimorphism in PD: women show a lower risk of developing the disease. This difference could be due to sexual hormones, estrogens in particular. Goals: the main goal of my this work is to understand if there is a difference between male, female and ovariectomized (OVX) mice in the progression of nigrostriatal damage and in microglia's activation, in a murine model of PD. Materials and methods: Male, female and OVX (C57BL/6N 9-11 weeks) mice have been operated with stereotaxic surgery under general anestethic conditions (Equithesin, 3mL/Kg, i.p.) and have riceveid a 6-OHDA infusion (2μg/μL saline – 0.02% ascorbic acid) into the right striatum. At different time points (male and female mice 1, 2, 3, 7, 14 and 21 days after surgery; OVX 1, 7 and 14 days after surgery) the animals were sacrificed with an intracardiac perfusion with saline and paraformaldehyde; the brains have been removed and crioprotected. All female mice have been operated in proestrous phase (estrogens maximum pick). All the brains have been sectioned with a sledge microtome; the coronal sections (20 μm) containing striatum and SNc have been used for: double immunofluorescent reaction using tyrosine hydroxylase (TH), a dopaminergic neuron's marker using to evaluate the nigrostriatal damage, and Iba1, a microglial cells' marker; triple immunofluorescent reaction using TH, Iba1 and CD206 or TNF-α, markers rispectively to M2 (citoprotective) or M1 (citotoxic) microglial phenotype. The evaluation of microglial activation has been performed using Colburn's scale which evaluates the increase in microglial cellular density and variation of their morphology. Results: Male mice show a major tendence, according to the spend time, to striatal damage's increase compared to the female one. Also at SNc level the neuronal lost is time-depending and there is a significant difference between the OVX at 7 days after surgery, which show a major loss of dopaminergic neurons, and the male and female mice evaluated at the same time. Moreover has been observed at SNc that microglial activation at 1 and 2 days after surgery is higher compared to 7 days evaluation one in both male and female mice. To what concern OVX, data obtained from immunofluorescent analysis show a microglial activation at 1 and 14 days after surgery. Data obtained from the triple immunofluorescent reactions suggest an early and slight microglial polarization toward M2 phenotype in male and female mice 1 day after surgery and a more late and slight one toward M1 phenotype in male mice at 2 days after surgery. Conclusion: The analysis of the progression of nigrostriatal damage highlights a significative difference between OVX at 7 days after surgery and male and female mice evaluated at the same time. The increased of nigrostriatal damage observed in OVX is probably due to the absence of estrogens.
Introduzione: La caratteristica della malattia di Parkinson (MP) è la degenerazione progressiva dei neuroni dopaminergici della Substantia Nigra Pars Compacta (SNc) con conseguente deplezione di dopamina a livello del corpo striato che ne riceve le proiezioni. L'eziopatogenesi della MP è molto complessa e multifattoriale; la neuroinfiammazione è certamente coinvolta e favorisce la progressione del danno neuronale. Dati epidemiologici suggeriscono l'esistenza di un dimorfismo sessuale nella MP: le donne mostrano un rischio inferiore di sviluppare la malattia. Tali differenze potrebbero essere attribuite agli ormoni sessuali, in particolare agli estrogeni. Obiettivi: Il principale obiettivo del mio lavoro di tesi è capire se esiste una differenza tra topi maschi, femmine e femmine ovariectomizzate (OVX) nella progressione del danno nigrostriatale e nell'attivazione microgliale, in un modello murino di MP. Materiali e metodi: topi maschi, femmine e OVX (C57BL/6N 9-11 settimane) sono stati sottoposti ad un intervento di chirurgia stereotassica in condizioni di anestesia generale (Equithesin, 3mL/Kg, i.p.) e hanno ricevuto un'infusione di 6-OHDA (2μg/μL salina – 0.02% acido ascorbico) a livello del corpo striato destro. A differenti tempi (topi maschi e femmine 1, 2, 3, 7, 14 e 21 giorni dopo la lesione; OVX 1, 7 e 14 giorni dopo la lesione) gli animali sono stati sacrificati per perfusione intracardiaca con salina e paraformaldeide; gli encefali sono stati rimossi e crioprotetti. I topi di sesso femminile sono stati operati tutti in fase di proestro (picco massimo degli estrogeni). Tutti gli encefali sono stati sezionati con un microtomo congelatore a slitta, le sezioni coronali (20μm) contenenti il corpo striato e la SNc sono state sottoposte alle seguenti colorazioni: doppia reazione di immunofluorescenza utilizzando tirosina idrossilasi (TH), un marcatore dei neuroni dopaminergici utilizzato per valutare il danno nigrostriatale, e Iba1, un marcatore delle cellule microgliali; tripla reazione di immunofluorescenza utilizzando, oltre TH e Iba1, CD206 o TNF-α, marcatori rispettivamente del fenotipo microgliale M2 (citoprotettivo) o M1 (citotossico). La valutazione dell'attivazione microgliale è stata effettuata usando la scala di Colburn che considera sia l'aumento della densità delle cellule microgliali sia le modificazioni della loro morfologia. Risultati: I topi maschi mostrano una maggiore tendenza all'aumento, nel tempo, del danno striatale rispetto alle femmine. Anche a livello della SNc la perdita neuronale è tempo-dipendente e vi è una differenza significativa tra le OVX a 7 giorni, che mostrano una maggiore perdita dei neuroni dopaminergici, e i topi di sesso maschile e femminile valutati alla solita tempistica. É stato inoltre osservato nella SNc che l'attivazione microgliale a 1 e 2 giorni dalla lesione è più alta rispetto a quella valutata a 7 giorni sia in topi maschi che femmine. Per quanto riguarda le OVX i dati ottenuti dall'analisi in immunofluorescenza mostrano un'attivazione della microglia a 1 e a 14 giorni dopo la lesione. I dati ottenuti dalle triple reazioni di immunofluorescenza indicano una precoce e lieve polarizzazione microgliale verso il fenotipo M2 in topi maschi e femmine a 1 giorno dalla lesione e una successiva, ma altrettanto lieve, verso il fenotipo M1 in topi maschi a 2 giorni dalla lesione. Conclusioni: L'analisi della progressione del danno nigrostriatale evidenzia una differenza significativa tra topi ovariectomizzati a 7 giorni e topi di sesso femminile e maschile valutati alla stessa tempistica. L’aumentata entità della lesione nigrostriatale osservata nelle OVX è probabilmente legata all’assenza di estrogeni.
Valutazione dell'effetto del genere e possibili meccanismi molecolari in un modello murino di malattia di Parkinson
DAVIDDI, FRANCESCA
2013/2014
Abstract
Introduction: The characteristic of Parkinson's disease (PD) is the progressive degeneration of dopaminergic neurons of Substantia Nigra Pars Compacta (SNc) with consequent dopamine depletion of the striatum, which receives the SNc projections. The ethiopathogenesis of PD is very complex and multifactorial; the neuroinflammation is certainly involved and contributes to the neuronal damage's progression. Epidemiological data suggest a sexual dimorphism in PD: women show a lower risk of developing the disease. This difference could be due to sexual hormones, estrogens in particular. Goals: the main goal of my this work is to understand if there is a difference between male, female and ovariectomized (OVX) mice in the progression of nigrostriatal damage and in microglia's activation, in a murine model of PD. Materials and methods: Male, female and OVX (C57BL/6N 9-11 weeks) mice have been operated with stereotaxic surgery under general anestethic conditions (Equithesin, 3mL/Kg, i.p.) and have riceveid a 6-OHDA infusion (2μg/μL saline – 0.02% ascorbic acid) into the right striatum. At different time points (male and female mice 1, 2, 3, 7, 14 and 21 days after surgery; OVX 1, 7 and 14 days after surgery) the animals were sacrificed with an intracardiac perfusion with saline and paraformaldehyde; the brains have been removed and crioprotected. All female mice have been operated in proestrous phase (estrogens maximum pick). All the brains have been sectioned with a sledge microtome; the coronal sections (20 μm) containing striatum and SNc have been used for: double immunofluorescent reaction using tyrosine hydroxylase (TH), a dopaminergic neuron's marker using to evaluate the nigrostriatal damage, and Iba1, a microglial cells' marker; triple immunofluorescent reaction using TH, Iba1 and CD206 or TNF-α, markers rispectively to M2 (citoprotective) or M1 (citotoxic) microglial phenotype. The evaluation of microglial activation has been performed using Colburn's scale which evaluates the increase in microglial cellular density and variation of their morphology. Results: Male mice show a major tendence, according to the spend time, to striatal damage's increase compared to the female one. Also at SNc level the neuronal lost is time-depending and there is a significant difference between the OVX at 7 days after surgery, which show a major loss of dopaminergic neurons, and the male and female mice evaluated at the same time. Moreover has been observed at SNc that microglial activation at 1 and 2 days after surgery is higher compared to 7 days evaluation one in both male and female mice. To what concern OVX, data obtained from immunofluorescent analysis show a microglial activation at 1 and 14 days after surgery. Data obtained from the triple immunofluorescent reactions suggest an early and slight microglial polarization toward M2 phenotype in male and female mice 1 day after surgery and a more late and slight one toward M1 phenotype in male mice at 2 days after surgery. Conclusion: The analysis of the progression of nigrostriatal damage highlights a significative difference between OVX at 7 days after surgery and male and female mice evaluated at the same time. The increased of nigrostriatal damage observed in OVX is probably due to the absence of estrogens.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/24806