Immobilizzazione di ɣ-glutamil transpeptidasi da rene di cavallo per la sintesi di sostanze kokumi

Kokumi is a Japanese term that refers to taste perception defined as having mouthfulness, thickness and a long-lasting savory sensation. Although being nearly tasteless in themselves, kokumi compounds are able to elicit strong taste sensations, especially when associated with protein-rich food, thus acting as true flavor enhancers. Kokumi compounds in nature are mainly -glutamyl derivatives of amino acids or modified amino acids. Despite their relatively simple chemical structure, the synthesis of -glutamyl derivatives through the classical peptide chemistry is not straightforward due to the need of protection and deprotection steps. Therefore, an enzymatic approach can represent an appealing solution for their supply. -Glutamyl transpeptidase (GGT, E.C. 2.3.2.2) is an intrinsic membrane enzyme which transfers the -glutamyl moiety of glutathione to acceptors producing -glutamyl derivatives. In this context, an immobilization study of the GGT from equine kidney (ekGGT) was performed with the aim to develop a robust biocatalyst for the synthesis of -glutamyl derivatives of industrial relevance. Different binding chemistry and chemical activation of the support as well as reaction conditions were assayed to set up a tailor-made immobilization protocol. Octyl/glyoxyl heterofunctional agarose resulted in a high immobilization yield and a good activity recovery. An optimization study was performed on the immobilization protocol, in order to evidence the critical steps for the best derivative. Moreover, the stability study of the derivative was carried out and the immobilized biocatalyst showed a remarkable stability keeping a residual activity greater than 95% after 6 days and resulted completely stable for seven cycles. In addition, Raman spectroscopy was applied to the immobilized ekGGT for the molecular characterization.

Kokumi è un termine giapponese che si riferisce alla percezione del gusto, definito come una maggiore gradevolezza al palato, pienezza, complessità e durata del sapore. Sebbene le sostanze kokumi siano senza gusto testate da sole, nel momento in cui sono aggiunte ad altri cibi riescono ad esaltarne il gusto, specialmente quando sono associate a cibi ricchi di proteine, funzionando quindi come esaltatori del gusto. I composti kokumi presenti in natura sono derivati di amminoacidi ɣ-glutammici. A dispetto della loro semplice struttura chimica, la preparazione di questi composti mediante sintesi chimica classica è resa complicata dalla necessità di passaggi di protezione e deprotezione. Per questo motivo, un approccio enzimatico può rappresentare un’alternativa per la loro produzione. L’enzima ɣ-glutamil transpeptidasi (GGT, E.C.2.3.2.2) è una proteina di membrana che trasferisce la subunità ɣ-glutammica dal glutatione ad un accettore, producendo i derivati ɣ-glutammici. In questo contesto, è stato sviluppato uno studio di immobilizzazione di GGT estratto da rene di cavallo (ekGGT), con lo scopo di produrre un robusto biocatalizzatore per la sintesi di derivati ɣ-glutammici di rilevanza industriale. Sono stati saggiati supporti con diversa chimica di legame e di attivazione, così come diverse condizioni di reazione, con lo scopo di mettere appunto un protocollo di immobilizzazione eterofunzionale. Uno studio di ottimizzazione è stato eseguito sul protocollo di immobilizzazione, al fine di evidenziare i passaggi critici per la preparazione del derivato enzimatico migliore in termini di attività e stabilità. Successivamente, uno studio di stabilità del derivato selezionato nelle condizioni di reazione ha mostrato che dopo sei giorni il biocatalizzatore manteneva un’attività residua maggiore del 95% e risultava completamente stabile dopo 7 cicli di reazione. Il derivato ekGGT immobilizzato è stato caratterizzato mediante spettroscopia Raman.