Una nuova via con cui i glioblastomi potenziano l'uptake del glucosio

Glioblastoma is the most common primary malignant SNC neoplasia in the adult population and, although the advances in surgical and radio-chemotherapic techniques, the prognosis is still poor. Moreover the cellular metabolism of glioblastoma depends mostly on glucose, that is used for the aerobic glycolysis. Our study wants to identify a new pathway by which glioblastoma cells enhance glucose uptake. For that purpose, U87-MG glioblastoma cells were grown after consumption of glucose in the medium by progressive metabolism or acute removal, finding that low glucose levels corresponded to high intracelluar levels of Shc3, an adaptor protein present in glioblastoma but not in normal astrocytes. Furthermore by growing U87-MG cells under standard conditions (glucose replaced every 24 h) and stressed (glucose replaced after 120 h) we noticed an increase not only of the levels of Shc3 isoforms but also of the rate of glucose consumption and lactate production in stressed cells. However the difference of glucose rate consumption between stressed and not-stressed cells was significantly reduced if cell membranes were permeabilized by saponin, suggesting that the effect of Shc3 is on glucose uptake and not on glycolysis rate. This hypothesis was confirmed in an experiment where we measured the uptake of 2-NBDG, a fluorescent analogue of 2-DG, that is not metabolized by cells, in stressed U87-MG cells with high Shc3 levels, finding high levels of marker in the cells. Since we know that glucose uptake in glioblastoma is mediated by GLUT/SLC2A trasporters , whose levels on cellular membrane are determined by the trafficking of clatrin-coated vesicles, we indentified by immunoprecipitation and mass spectroscopy several proteins, interacting with Shc3 and known to be involved in vesicles recycling and clatrin-mediated endocytosis: AP2, BMPK, MAP1 and vimentin. Moreover the increase of Shc3 levels in glucose starving was independent of AMPK activation (a marker of decreasing glucose concentration), as we showed the increase of Shc3 well before the beginning of AMPK phosphorilation. Even treating the cells with AMPK phosphorilation inducers or direct AMPK inhibitors didn't influence the kinetic of the increasing levels of Shc3. Therefore our results suggest the existence of a novel pathway by which gliblastoma cells enhances glucose uptake to deal with energy metabolism in glucose starvation. This pathway is independent of AMPK and is based on the increasing levels of Shc3, that influences vescicles recycling and promotes the exposure of GLUT/SLC2A transporters on cell membranes. This study is also important for translational research about glioblastoma, since all proteins interacting with Shc3 in vescicles trafficking are potential targets of new drugs, of which some are still under clinical trial and the results of our studies explain their molecular mechanism of action

Il glioblastoma è la più comune neoplasia primitiva maligna del SNC nella popolazione adulta e, nonostante le attuali terapie chirurgiche e radio-chemioterapiche, la sua prognosi rimane tutt’ora infausta. Il glioblastoma ha un metabolismo cellulare strettamente dipendente dal glucosio, che utilizza per la gliocolisi aerobia. Il nostro studio mira a identificare una nuova via con cui le cellule di glioblastoma potenziano l’uptake del glucosio. A tal fine abbiamo fatto crescere in coltura cellule di glioblastoma umano della linea U87-MG rimuovendo il glucosio dal mezzo di coltura acutamente o per progressiva metabolizzazione; in queste condizioni abbiamo trovato che a bassi livelli di glucosio corrispondevano aumenti dei livelli intracellulari di Shc3, una proteina adattatrice presente in alti livelli nelle cellule di glioblastoma ma non negli astrociti non attivati. Le stesse cellule mantenute in un medium di coltura non sostituito se non dopo 120 ore quando il glucosio è completamente consumato presentano un aumento di Shc3 e, se vengono poi esposte a un medium con alti livelli di glucosio, aumentano la loro velocità di consumo di glucosio e produzione di lattato rispetto alle cellule in condizioni standard (medium sostituito ogni 24 ore). La differenza nella velocità di consumo del glucosio tra cellule stressate non si verifica se le membrane cellulari sono permeabilizzate con saponina così che il glucosio possa entrare liberamente senza necessità di trasportatori. Questo risultato suggerisce che l'aumento di Shc3 agisce sul trasporto del glucosio e non sulla velocità/efficienza della glicolisi. Tale ipotesi è stata confermata in un esperimento in cui abbiamo misurato l’uptake di 2-NBDG, un analogo fluorescente del 2-desossiglucosio che entra nella cellula attraverso gli stessi trasportatori del glucosio, ma che dopo essere stato fosforilato si accumula all’interno della cellula non potendo essere ulteriormente metabolizzato. Abbiamo infatti confrontato l'accumularsi di 2-NBDG in cellule U87-MG coltivate in condizioni normali oppure sottoposte a stress metabolico, trovando che l'ingresso di 2-NBDG era maggiore nelle cellule stressate. Poiché è noto che l’uptake del glucosio nel glioblastoma è mediato soprattutto dai trasportatori GLUT/SLC2A, i cui livelli sulla membrana cellulare dipendono dal ricircolo intracellulare delle vescicole ricoperte da clatrina, abbiamo confermato con esperimenti di immunoprecipitazione e spettrometria di massa che Shc3 interagisce con alcune proteine, note per essere coinvolte nell’endocitosi mediata dalla clatrina: AP2, BMP2K, MAP1, vimentina. Inoltre abbiamo dimostrato che l’aumento dei livelli intracellulari di Shc3 in carenza di glucosio è indipendente dall’attivazione di AMPK (indotta da un aumento del rapporto AMP/ATP intracellulare), poiché l’aumento di Shc3 era evidenziabile nelle cellule molto più precocemente dell’inizio della fosforilazione di AMPK. Anche il trattamento delle cellule con induttori della fosforilazione di AMPK o con inibitori diretti di AMPK non ha influenzato la cinetica dell’aumento intracellulare di Shc3. I nostri risultati, dunque, dimostrano l’esistenza di una nuova via con la quale le cellule di glioblastoma aumentano l’uptake del glucosio per far fronte alle condizioni di carenza di glucosio, che è indipendente da AMPK e basata sull’incremento dei livelli intracellulari di Shc3, che, influenzando il traffico delle vescicole, causa un aumento del numero dei trasportatori GLUT/SLC2A sulla membrana cellulare. Questo studio ha importanti ricadute sulla ricerca traslazionale per lo sviluppo di nuove terapie per il glioblastoma, poiché tutte le proteine interagenti con Shc3 nella circolazione delle vescicole sono potenziali bersagli di nuovi farmaci per bloccare la crescita tumorale.