Encapsulation of Pirfenidone in Polymeric Nanoparticles for Treating Fibrotic Scars in Deep Partial Thickness Burns

Burns are the fourth most common type of trauma worldwide, following traffic accidents, falls, chemotherapy treatment and interpersonal violence. Burn injuries are one of the most devastating of all injuries because burn scar evolution generally leads to scar contractures and hypertrophic scars (HS), in particular for deep partial thickness (DPT) burns [EE. Tredget et al. 2014, LW. Qian et al. 2016]. Scar severity being unpredictable in the first 10 – 15 days after injury, therefore it warrants consideration of how to avoid abnormal scar formation. Besides HS could be a cause of physical and psychological morbidity and long-term hospitalization [H. Karagoz et al 2012]. Pirfenidone (PF), an FDA-approved anti-fibrotic drug indicated for treatment of idiopathic pulmonary fibrosis, is a small molecular weight (185 g/mol) pyridinone with the chemical name of pyridine (5-methyl-1-phenyl-2-(1H)-pyridinone). PF has proven anti-fibrotic/anti-inflammatory activity in organs in addition to the lung, such as the liver, heart, kidney, nevertheless in treatment effect on reducing skin fibrosis and diminishing excessive scarring has not been fully studied. It has been proven that PF is effective in lessening transforming growth factor (TGF)-β1 effects on the differentiation of human dermal fibroblasts into fibrotic myofibroblasts, the cell phenotype that promotes wound fibrosis (scarring). PF decreased fibroblast proliferation and migration as well as lessened the pro-fibrotic phenotype of myofibroblasts with reduced production of α-smooth muscle actin (α-SMA), stress fibers, and collagen. TGF-β1 stimulated differentiation of dermal fibroblasts to myofibroblasts and suggested that PF inhibits mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways downstream of receptors for growth factors, cytokines, and stress sensors as its mechanisms of action. MAPK pathways have been implicated in promoting myofibroblast differentiation signaled by TGF-β in rat myofibroblasts [R. Dorati et al. 2018 and J.L. Medina et al. 2018]. In past few decades the use of nanotechnology in pharmaceutical-medical field spread rapidly improving the therapeutic value of various water soluble/insoluble drugs preventing premature drug degradation, enhancing cell uptake and particularly controlling the release of drug from the nanoparticulate systems [A.H. Faraji et al 2009]. The aim of the study was to encapsulate PF into biodegradable and biocompatible nanoparticles (NPs) and to achieve a more effective and easily scalable preparation technique to produce PF-loaded polymeric NPs. Solubility and stability of PF in organic solvents and buffers have been evaluated during the preformulation study; following the NPs were synthetized by microfluidics technology which is an emerging technology allows reproducible mixing of fluids in milliseconds range and on the nanoliter scale. In our investigation, several formulation variables (such as type of polymer, organic solvent, pH and molarity of aqueous phase) have been tested in order to maximize the encapsulation of PF into the NPs maintaining particle size < 220 nm. Characterization of produced nanoparticles was performed in terms of (i) size and polydispersity index (PDI) and (ii) zeta potential detected by dynamic light scattering (DLS) apparatus; (iii) qualitative analysis of materials by FTIR; (iv) morphological examination by TEM and AFM (v) PF encapsulation efficiency (EE %) by HPLC; and (vi) stability in physiological simulated conditions.

Le ustioni sono il quarto tipo di trauma più comune in tutto il mondo, in seguito ad incidenti stradali, cadute, chemioterapia e violenze interpersonali. Le ferite causate dalle ustioni sono tra le lesioni più devastanti, poiché l'evoluzione della cicatrice causa generalmente contratture cicatriziali e cicatrici ipertrofiche, in particolare per ferite profonde [E.E. Tredget et al. 2014, L.W. Qian et al. 2016]. Nei primi 10 - 15 giorni dopo l'infortunio, l’ evoluzione della cicatrice è imprevedibile, pertanto richiede una maggiore attenzione per evitare la formazione anormale di cicatrici. Le cicatrici ipertrofiche sono spesso causa di morbilità fisica e psicologica accompagnata da lunghi periodi di ospedalizzazione [H. Karagoz et al 2012]. Il Pirfenidone (PF), è un farmaco antifibrotico approvato dalla FDA per il trattamento della fibrosi idiopatica polmonare; chimicamente è un piridinone con basso peso molecolare (185 g/mol), noto come piridina (5-metil-1-fenil-2-(1H)-piridinone). Il PF ha dimostrato avere un'attività antifibrotica/ antinfiammatoria a livello polmonare ed in altri organi, come il fegato, il cuore e i reni; gli eventuali effetti su fenomeni di fibrosi cutanea non sono anacora stati studiati a fondo. È stato dimostrato che la PF è efficace nel ridurre gli effetti del fattore di crescita trasformante (TGF-β1) che agisce sul differenziamento dei fibroblasti dermici umani in miofibroblasti fibrotici e sul fenotipo cellulare che promuove la fibrosi della ferita (cicatrizzazione). Il PF agisce diminuendo la proliferazione e migrazione dei fibroblasti e riducendo il fenotipo pro-fibrotico dei miofibroblasti con una ridotta produzione di α-actina a livello della muscolatura liscia (α-SMA), di fibre di stress e di collagene. Il TGF-β1 stimola i fibroblasti dermici al differenziamento in miofibroblasti, ciò suggerisce che il PF inibisce il pathway della protein chinasi attivato da mitogeno (MAPK) a valle dei recettori per i fattori di crescita, le citochine ed i sensori di stress come meccanismi d'azione. Inoltre il pathway delle MAPK è implicato nella promozione del differenziamento in miofibroblasti dal TGF-β, osservata nei miofibroblasti di ratto [R. Dorati et al 2018 e J.L. Medina et al 2018]. Negli ultimi decenni l'uso delle nanotecnologie nel campo farmaceutico-medico si è diffuso rapidamente migliorando il valore terapeutico di vari farmaci solubili/ insolubili in acqua, diminuendo la degradazione precoce del farmaco, migliorando l'assorbimento cellulare ed in particolare controllando il rilascio di farmaci dai sistemi nanoparticellari [A.H. Faraji et al 2009]. Lo scopo del presente lavoro di tesi è incapsulare il PF in nanoparticelle biodegradabili e biocompatibili (NP) al fine di ottenere una formulazione per il trattamento di cicatrici ipertrofiche e sviluppare un protocollo di produzione di NP polimeriche cariche di PF mediante una tecnologia innovative. Durante lo studio preformulativo sono state valutate la solubilità e la stabilità del PF in solventi organici e tamponi; a seguire le NP sono state sintetizzate tramite tecnica microfluidica, una tecnologia emergente che consente la miscelazione riproducibile di fluidi in millisecondi e su scala di nanolitri. Nel nostro studio, sono state testate diverse variabili di formulazione (come il tipo di polimero, solvente organico, pH e molarità della fase acquosa) al fine di massimizzare l'incapsulamento di PF nelle NP mantenendo la dimensione delle particelle <220 nm. La caratterizzazione delle nanoparticelle è stata eseguita in termini di (i) dimensioni, indice di polidispersità (PDI), (ii) potenziale zeta rilevato dall'apparecchio di diffusione dinamica della luce (DLS); (iii) l’ analisi qualitativa dei materiali da parte di FTIR; (iv) esame morfologico mediante TEM e AFM; (v) l’ efficienza di incapsulamento del PF (EE%) mediante HPLC e (vi) la stabilità in condizioni fisiologiche simulate.