Studio dell'interazione tra cellule e nanoparticelle di ceria: adesione ed internalizzazione

In recent years, nanotechnology has received an increasing interest in multiple fields, especially in the field of biology and medicine: the term “nanomedicine” means, in fact, the application of nanotechnology and nanoparticles to medicine. Different potential applications of nanoparticles are possible for a therapeutic purpose, first among all their use as drug delivery, especially for cancer and neurodegenerative diseases. In addition to nanoparticles as vehicle to deliver molecules of interest, there are also nanoparticles in which it is the material that form the nanoparticle itself that shows interesting properties for a possible application: a clear example is given by cerium dioxide nanoparticles (CNP) that, through their particular chemical structure, can take part to redox reactions. For this reason the CNP can be exploited as scavengers for free radicals, with a possible application in those diseases characterized by oxidative stress. To be exploited in the biological field, nanoparticles should be characterized by different physico-chemical properties such as good solubility as well as good biocompatibility. Furthermore, it is very important that nanoparticles can be taken up and internalized by cells, in order to be able to develop their biological activity at the intracellular level. This work focused on the interaction between CNP and cells, using HeLa cell line as cellular model. In particular, two different types of CNP in terms of coating were studied: CNP functionalized with polyacrilic acid (ACNP) and CNP functionalized with dextran (DCNP). Once nanoparticles biocompatibility was tested and once the right nanoparticles concentrations to be used in the nanoparticles-cell interaction experiments was found, then the CNP adhesion to cells was evaluated. While ACNP showed a good rate of adhesion, DCNP gave not the same result. For this reason, the attention was subsequently focused on the ACNP only. The mechanism of ACNP adhesion to cells was studied in deep, as well as their possible cellular uptake. The ACNP showed to be internalized in a time- and dose-dependent manner. It was also possible to discover two particular aspects of the uptake mechanism: a cellular non-homogeneous nanoparticles uptake and the ACNP specificity for the cell microvilli. The nanoparticles adhesion to microvilli could suggest a possible explanation for the inhomogeneities of the nanoparticles uptake by different cells in the same monolayer: since the number of microvilli is shown to depend on the cell cycle phase, it was hypothesized a possible link between the cell cycle and the degree of nanoparticles uptake. However this aspect has not been completely proven yet and is still under investigation. Therefore, this study allowed to move from the nanoparticles chemical synthesis to their interaction with the biological systems. The results clearly showed that coating as well as size are determinant factors for the nanoparticles-cell interaction, like adhesion and uptake. Thanks to the ACNP small size and to their high stability in the biological medium, a new and peculiar mechanism of adhesion involving microvilli was shown. These interesting finding deserves more investigations since such a novel nanoparticle-cell interaction mechanism could be exploited to maximize the uptake of nanoparticles, especially in view of possible applications in nanomedicine.

Con il termine “nanomedicina” si intende l’applicazione e l’utilizzo delle nanotecnologie e delle nanoparticelle a fini terapeutici. Svariate sono infatti le possibili applicazioni delle nanoparticelle in ambito terapeutico, primo fra tutti il loro utilizzo come elemento di drug delivery, specialmente nel campo dei tumori e delle malattie neurodegenerative. Oltre a tale utilizzo, vi sono anche nanoparticelle in cui è lo stesso materiale che le costituisce ad avere proprietà interessanti dal punto di vista applicativo. Un chiaro esempio sono le nanoparticelle di ceria (CNP) che, grazie alla particolare struttura chimica del cerio che le costituisce, possono prender parte a reazioni di ossido-riduzione e per questo motivo trovano spazio come possibili materiali con attività antiossidante, importanti in tutte quelle patologie caratterizzate dalla presenza di stress ossidativo. Per poter essere sfruttate in ambito biologico le nanoparticelle devono soddisfare svariate caratteristiche chimico-fisiche che ne consentano per esempio una buona dispersione nei mezzi biologici così come un’adeguata biocompatibilità. Fondamentale è inoltre la possibilità da parte delle nanoparticelle di poter essere captate dalle cellule in modo tale da esercitare la loro attività a livello intracellulare. In questo lavoro di tesi è stata studiata l’interazione tra nanoparticelle di ceria e cellule in coltura, utilizzando come modello cellulare le cellule HeLa. In particolare sono state saggiate due diverse tipi di CNP, differenti per il tipo di funzionalizzazione: CNP rivestite con acido poliacrilico (ACNP) e CNP rivestite con destrano (DCNP). Una volta saggiata la biocompatibilità delle nanoparticelle e ricavate le concentrazioni utili ai fini sperimentali, si è cercato innanzitutto di valutare se vi fosse adesione delle CNP a livello delle cellule. Mentre le ACNP mostravano un buon grado di adesione, le DCNP non hanno fornito lo stesso risultato. Per questo motivo l’attenzione si è focalizzata sulle sole ACNP. È stato quindi approfondito il meccanismo di adesione delle ACNP alle cellule così come la loro successiva internalizzazione. Le ACNP venivano effettivamente internalizzate e la captazione è risultata sia tempo che dose-dipendente. È stato inoltre possibile evidenziare degli aspetti del tutto peculiari nel meccanismo di captazione: da un lato è stata notata una disomogeneità nel grado di captazione delle nanoparticelle da parte delle cellule, dall’altro si è evidenziata una specificità di adesione delle nanoparticelle a particolari strutture cellulari, rivelatesi poi essere i microvilli. La specificità di legame delle ACNP ai microvilli ha inoltre suggerito una possibile interpretazione della disomogeneità di captazione delle NP osservata sui monostrati cellulari: dal momento che il numero di microvilli risulta correlato alla fase del ciclo cellulare, è stato ipotizzato un possibile legame tra la fase del ciclo in cui si trova una cellula e la sua capacità di captazione delle nanoparticelle. Questo aspetto, tuttavia, è ancora sotto investigazione. Lo studio ha così consentito il passaggio dalla sintesi chimica delle nanoparticelle di ceria alla loro valutazione su sistemi cellulari. È risultato chiaro come il tipo di cappante così come le ridotte dimensioni delle nanoparticelle siano essenziali nel determinarne l’adesione e la modalità di captazione da parte delle cellule. Proprio grazie alle ridotte dimensioni e all’estrema stabilità delle ACNP utilizzate, è stato evidenziato un meccanismo di captazione del tutto nuovo e non ancora descritto in letteratura, coinvolgente i microvilli. Questo aspetto peculiare merita certamente ulteriori approfondimenti in quanto tale specificità potrebbe rappresentare un meccanismo efficiente nel massimizzare la quantità di nanoparticelle internalizzate, aspetto molto interessante in un’ottica applicativa.