Sintesi e caratterizzazione di ligandi bivalenti dei recettori sigma-1, quali “tools farmacologici” per lo studio della dimerizzazione recettoriale.

The strategies of “drug design” that has been used in the last 20 years are based on the following concept: every disease has a biological target, which can be modulated by selective and potent ligands . Many diseases, have a high degree of complexity and the use of a simple modulator gives not rise to an adequate biological response. An interesting approach recently proposed to overcome this critical issue is combining two bioactive molecules in an unique. Indeed, many receptors, having an important role in the human body are founded in dimeric form in both physiological and pathological conditions. During my thesis project, performed in the medicinal chemistry laboratory, I performed the synthesis and the characterization of potential sigma-1 receptors ligands, as pharmacological tools useful to study dimerization of the receptors as consequence of ligand-receptor interaction. Sigma-1 receptor is an integral membrane protein, which is composed of two trans-membranal domain: it can be involved in several central nervous system diseases. They are proteins made of 223 aminoacids, which have a molecular weight of about 26,3 kDa, and are situated on the endoplasmatic reticule at the interface with the mitochondria. The sigma-1 receptor is modulated by endogenous ligands, like the hallucinogen N,N-dimethyltryptamine (DMT) progesteron e sfingosine. In 2009 DMT has been proposed as the endogenous ligand; This hypothesis has not been demonstrated yet and nowadays the real endogenous ligand still remains undiscovered. Recent studies (2013), carried out by Ruoho, showed that sigma-1 receptors are in dimeric form. This hypothesis has been confirmed recently, in March 2015, by Ruoho et al, who demonstrated that sigma-1 receptor is in dimeric form during its activity, also in absence of its ligands. The various forms in which the sigma-1 receptor can exists are important to modulate its various functions. The main aim of my thesis project is to design and synthesis bivalent ligands, as monomeric unit we select RC-33 (Fig.2), a sigma-1 agonist with high affinity (Ki=0,70 ±0,3 nM). Therefore I prepared RC-33 analogues, both in monomeric and in dimeric form. Taking into account that to date no information are available regarding the “real” dimerization state of sigma-1 receptor, spacers of different length and nature were used. The structure and the identity of compound was confirmed through IR, melting point, H1-NMR and the purity was analyzed by HPLC analysis. Bindings assays are under examination now.

Le strategie di “drug design” utilizzate negli ultimi 20 anni si basano sul concetto che ad ogni patologia è correlato un target biologico, il quale può essere modulato da un ligando, selettivo e potente. Tuttavia molte patologie sono legate a sistemi biologici molto complessi e l’utilizzo di un semplice ligando porta a una modulazione non sufficiente. Una delle nuove promettenti strategie di “drug design” consiste, quindi, nel combinare due entità farmacologiche in un singolo composto. Questo approccio sta suscitando particolare interesse in quanto è stato dimostrato molti recettori si trovano in forma dimerica in condizioni fisiologiche o dimerizzano in condizioni di stress o di patologia. Durante il mio internato di tesi, svolto presso il laboratorio di chimica farmaceutica, mi sono occupata della sintesi e caratterizzazione di potenziali ligandi dimerici dei recettori sigma-1, quali tools farmacologici per lo studio della dimerizzazione in seguito ad interazione con il recettore. I recettori sigma-1 sono proteine integrali di membrana caratterizzati da due domini transmembrana che sembrano essere coinvolti in numeroso patologie del sistema nervoso centrale. Si tratta di una proteina di 223 amminoacidi avente un peso molecolare di 26,3 kDa, localizzata sul reticolo endoplasmatico all’interfaccia con i mitocondri. I recettori σ1 sono modulati da molecole endogene diverse quali la N,N-dimethyltryptamine (DMT), il progesterone e la sfingosina. Nel 2009 proprio la DMT è stata proposta quale ligando endogeno; tale ipotesi non ha ancora, tuttavia, trovato conferma e oggigiorno il ligando endogeno rimane ancora sconosciuto. Studi molto recenti (2013) condotti da Ruoho dimostrarono che i recettori sigma si trovano in forma dimerica. Questa ipotesi è stata confermata molto recentemente, nel marzo 2015, sempre da Ruoho e dai suoi collaboratori che hanno evidenziato l’ipotesi che il recettore sigma non si trova in forma dimerica solo se attivato ma anche a prescindere dalla presenza/assenza di ligandi. Inoltre, si suggerisce, che l’eterogeneità delle varie forme in cui si può trovare il recettore sigma siano un fattore importante per la possibilità di regolare le varie funzioni del recettore stesso. Scopo del mio lavoro di tesi è stato, quindi, progettare e sintetizzare ligandi bivalenti con lo scopo di disporre di molecole in grado di confermare la natura dimerica che il recettore sigma assume ed in seguito ad interazione da parte di un agonista. Quale composto di riferimento è stato preso il composto RC-33 che è un agonista sigma-1 che ha una buona affinità verso quest’ultimo (Ki=0,70 ±0,3 nM). Il mio lavoro è consistito nella preparazione di analoghi di RC-33 funzionalizzato in modo da consentire il raddoppio molecolare. Per il raddoppio molecolare sono stati utilizzati spaziatori di diversa lunghezza. L’identità dei composti è stata confermata tramite H1-NMR. I saggi di binding sono attualmente in corso.