Sviluppo e caratterizzazione di bioreattori a base di nucleoside fosforilasi per la sintesi in flusso di nucleosidi

Il progetto di ricerca di questa tesi è stato focalizzato sullo sviluppo di nuove strategie biocatalitiche e metodologie ecosostenibili per la sintesi di nucleosidi. Negli ultimi anni la sintesi chemoenzimatica di composti di interesse farmaceutico è divenuta una valida alternativa per l’ottenimento di prodotti commerciali normalmente prodotti per vie sintetiche tradizionali (e.g. vidarabina). Lo scopo del presente lavoro di tesi era sviluppare un sistema di sintesi in flusso in grado di catalizzare una reazione di transglicosilazione bienzimatica. Due sono stati gli enzimi considerati: purina nucleoside fosforilasi da Aeromonas hydrophila (AhPNP) e uridina fosforilasi da Clostridium perfrigens (CpUP), entrambi appartenenti alla famiglia delle nucleoside fosforilasi; AhPNP è un enzima selettivo per le basi puriniche mentre CpUP per le basi pirimidiniche. E’ stato dapprima sintetizzato un bioreattore mediante co-immobilizzazione dei due enzimi su supporto cromatografico a base di silice propilamminica. Il bioreattore è stato quindi inserito in un sistema HPLC bidimensionale. Il sistema cromatografico utilizzato si ispira a quello descritto da Calleri et al. nel 2015. La differenza sostanziale è che in questo sistema si accoppia la reazione di fosforolisi catalizzata dall’enzima CpUP a quella di transglicosilazione catalizzata dall’ enzima AhPNP. Le reazioni vengono eseguite all’ interno di un primo sistema cromatografico che lavora secondo i principi della flow chemistry dove la miscela dei reagenti viene fatta fluire attraverso il bioreattore. I substrati vengono quindi separati dai prodotti utilizzando un secondo sistema cromatografico accoppiato al precedente tramite una valvola di commutazione. Le variabili più significative che rientrano nel processo biocatalizzato (rapporto molare donatore di zucchero e base, concentrazione di fosfato, temperatura e pH) sono state valutate mediante uno studio di experimental design. La scarsa stabilità del bioreattore ottenuto dalla co-immobilizzazione dei due enzimi ha suggerito la preparazione di due bioreattori separati da utilizzare in linea secondo lo schema di sintesi. Anche in questo caso è stato condotto uno studio di experimental design. Le condizioni sperimentali ottimizzate sono state utilizzate per la sintesi di tre nucleosidi tra cui l’antivirale Vidarabina.