Approcci bioinformatici e molecolari per l’identificazione di geni utili in applicazioni di biodegradazione di composti volatili.

In this thesis work has been carried out the microbiological and molecular characterization of some enviromental isolates (KF, CT, PK) belonging to the general Bacillus, Citrobacter and Pseudomonas, in order to identify useful traits for the biodegradation of volatile compounds. The experimental work was carried out in collaboration with a leader Company in bioremediation of volatile pollutants, that design new generations biofilters inoculated with microbial consortia specifically selected to optimze the system effectiveness. With microbiological tests that use selective growth substrates has been possible to verify that the isolates under study produce extracellular enzymes, such as protheases, lipases and DNase, that could be used in many industrial fields. The isolates are currently tested in the form of microbial consortia extrimely effective in degradation of volatile pollutants, aromatic hydrocarbon in particular. When these consortium are inoculated in the biofilters, they need to be monitored in order to prevent any fluctuations in bacteria’s metabolic activity due to situation of enviromental stress or for the appearance of contaminants. The use of molecular techniques (standard PCR and Quantitative Real Time PCR) for the monitoring of active bacterial consortia in bioremediation processes, requires the availability of markers genes able to identify the microorganism and specific metabolic pathways associated with it. In this thesis was started a bioinformatics investigation that has helped to identify key genes involved in the important stage of the degradation metabolism of aromatic hydrocarbons, from reference strains of Bacillus, Pseudomonas and Citrobacter in the databases. Based on the DNA sequences, oligonucleotides (both degenerated and not) were designated that allowed us to identify and then clone the corresponding genes in the environmental isolates FK, CT, PK in bacterial consortium present in the biofilters.

In questo lavoro di tesi è stata effettuata la caratterizzazione microbiologica e molecolare di alcuni isolati ambientali (KF, CT, PK) appartenenti ai generi Bacillus, Citrobacter e Pseudomonas, allo scopo di individuare tratti utili per applicazioni di biodegradazione di composti volatili. L’attività sperimentale è stata svolta in stretta collaborazione con un’Impresa leader nel settore del biorisanamento di inquinanti volatili che progetta biofiltri di nuova generazione inoculati con consorzi microbici selezionati ad hoc per ottimizzare l’efficacia del sistema. Sulla base di test di tipo microbiologico che utilizzano substrati di crescita selettivi è stato possibile verificare che gli isolati oggetto di studio producono enzimi extracellulari, quali proteasi, lipasi e DNasi, che potrebbero essere utilizzati in molteplici ambiti industriali. Gli isolati sono attualmente testati nella forma di consorzi microbici estremamente efficaci nella degradazione di inquinanti volatili, in particolare idrocarburi aromatici. Questi consorzi necessitano, una volta inoculati nei biofiltri, necessitano di essere monitorati allo scopo di prevenire eventuali fluttuazioni nel’attività metabolica dei batteri dovute a situazioni di stress ambientale o alla comparsa di contaminanti. L’utilizzo di tecniche molecolari (PCR standard e Quantitative RealTime PCR) per il monitoraggio di consorzi batterici attivi in processi di biorisanamento richiede la disponibilità di geni marcatori in grado di identificare il microrganismo e le specifiche vie metaboliche ad esso associate. In questo lavoro di tesi è stata avviata un’indagine bioinformatica che ha consentito di individuare alcuni geni chiave coinvolti in passaggi cruciali del metabolismo di degradazione degli idrocarburi aromatici, a partire da ceppi di riferimento di Bacillus, Citrobacter e Pseudomonas presenti nelle banche dati. Sulla base delle sequenze di DNA sono stati designati oligonucleotidi (degenerati e non) che hanno consentito di identificare e successivamente clonare i corrispondenti geni negli isolati ambientali. Questi geni saranno utilizzati come marcatori per sviluppare protocolli per la tracciabilità degli isolati KF, CT, PK nei consorzi batterici presenti nei biofiltri.