Patient-Derived Organoids (PDO) da carcinoma mammario: isolamento, coltura e caratterizzazione

Breast cancer is the most common cancer in female population and it is an heterogeneous and complex disease. Tumour heterogeneity represents the main obstacle for the development of new therapeutic strategies since now available tumour models are not able to recapitulate it. Patient-Derived Organoids (PDO) represents an emerging three dimensional model for the study of tumour biology and pharmacological response, appearing very promising to develop personalized medicine approaches. PDOs are ex vivo models of primary tumour able to completely resume cancer heterogeneity, which could be applied both in basic and in translational research. Although, there are several studies applying this technology with colorectal and pancreatic cancers, only a few studies using breast cancer PDOs have been published. In this thesis work, a new experimental protocol has been developed to obtain PDOs from surgical samples of breast cancer patients, in order to integrate the oncological biobank Bruno Boerci with this kind of samples. Furthermore, methodologies for the morphological characterization of PDOs using immunohistochemistry and transmission electron microscopy have been developed and tested. Besides these, also cytometric analysis have been performed characterize the cellular populations in the tumor compartment. At the IRCCS ICS Maugeri of Pavia, 108 patients with diagnosis of breast cancer have been recruited, collecting and processing 216 surgical tumour samples using the new experimental protocol here described. 216 PDOs were quickly and easily obtained from both tumour and healthy tissue. However, only some them have been really cultured since the type of tissue of origin (tumour or healthy) and the poor amount of material obtained in some cases after the enzymatic digestion have discouraged to proceed further. The adopted experimental protocol allowed to obtain 87% success rate with 187 PDOs cultured, of which 79 derived from healthy tissue (42%) and 108 derived from tumor tissue (58%). Furthermore, the model showed concordance with the primary tumour of origin in histological and immunocytochemical analysis. Although the procedure to obtain PDO presents a good success rate, the subsequent creation of a stable line of breast cancer organoids that is able to grow and to be frozen for long-term biobank conservation has not displayed optimal yields yet, because it is strongly influenced by the biological portrait of the tissue of origin and it is heavily dependent on the quantity of material obtained at the end of the digestion process. Future studies will allow us to identify the biological determinants associated with the successful expansion and freezing of PDO line for biobank, in order to increase the success rate of the process.

Il carcinoma mammario è la neoplasia maligna più frequente nelle donne ed è una malattia eterogenea e complessa. L'eterogeneità tumorale rappresenta il principale ostacolo nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche poiché i modelli tumorali ad oggi disponibili non sono in grado di ricapitolare quest'aspetto. Il sistema di coltura tridimensionale dei Patient-Derived Organoids (PDO) costituisce un modello emergente per lo studio della biologia del tumore e della risposta farmacologica e sembra essere molto promettente per sviluppare approcci di medicina personalizzata. I PDO rappresentano un modello ex vivo del tumore primario in grado di ricapitolarne appieno l'eterogeneità e possono trovare applicazione sia nella ricerca di base che nella ricerca traslazionale. Nonostante siano stati numerosi gli studi riguardo all'uso di questa nuova tecnologia nel caso del carcinoma del colon-retto e del pancreas, fino ad oggi sono solo un paio gli studi pubblicati sfruttando i PDO di carcinoma della mammella. In questo lavoro di tesi è stato sviluppato un nuovo protocollo sperimentale per ottenere i PDO da campioni chirurgici di pazienti con carcinoma mammario, al fine di integrare la biobanca oncologica Bruno Boerci con organoidi da carcinoma mammario. Inoltre, sono state messe a punto e testate metodologie per la caratterizzazione morfologica dei PDO sfruttando l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a trasmissione. Sono state effettuate analisi citometriche per analizzare e caratterizzare le popolazioni cellulari che compongono il tumore. Presso l'IRCCS ICS Maugeri di Pavia sono stati reclutati 108 pazienti con diagnosi di carcinoma mammario da cui sono stati raccolti e processati 216 campioni tumorali chirurgici sfruttando il nuovo protocollo sperimentale descritto in questa tesi. Sono stati ottenuti 216 PDO sia da tessuto tumorale sia da tessuto sano in modo semplice e veloce. Tuttavia, solo una parte di essi è stata messa effettivamente in coltura poiché, in alcuni casi, il tipo di tessuto di origine (tumorale o sano) e l'esigua quantità di materiale ottenuto a seguito della digestione enzimatica hanno suggerito fosse meglio non procedere ulteriormente. Il protocollo sperimentale adottato ha permesso di ottenere un tasso di successo dell'87% con 187 PDO messi in coltura, di cui 79 derivati da tessuto sano (42%) e 108 da tessuto tumorale (58%). Inoltre, il modello ha mostrato concordanza con il tumore primario di origine nell'analisi istologica e immunocitochimica. Nonostante la procedura di ottenimento di PDO abbia ottime percentuali di successo, la successiva creazione di una linea di organoidi da carcinoma mammario stabile che sia in grado di crescere e di essere congelata per la conservazione in biobanca a lungo termine non ha ancora rese ottimali, poiché risente fortemente delle caratteristiche biologiche del tessuto di origine ed è fortemente dipendente dalla quantità di materiale ottenuto al termine del processamento. Studi futuri ci permetteranno di identificare i determinanti biologici associati alla riuscita dell'espansione e del congelamento della linea di PDO per biobanca, al fine di implementare le percentuali di riuscita del processo.