Studio del meccanismo d’azione di un inibitore della sintasi del Quorum Sensing CepI di Burkholderia cenocepacia.

Burkholderia cenocepacia is an opportunistic respiratory pathogen, particularly relevant for Cystic Fibrosis patients. It is difficult to eradicate due to its high level of resistance to most clinically relevant antimicrobials. Therefore, the discovery of new antimicrobials, as well as molecules able of inhibiting its virulence, is mandatory. In this regard, Quorum Sensing (QS) is a good target for anti-virulence therapies, as it has been linked to the production of several virulence factors. New compounds interfering with QS should block the production of virulence determinants, thus reducing bacterial capacity to colonize the host. Moreover, this approach does not kill the bacteria, making the resistance less probable. All Bcc species possess at least one QS system consisting of an Acyl Homoserine Lactone (AHL) synthase and an AHL corresponding receptor. One of the B. cenocepacia AHL QS systems is CepIR. In this thesis, it is reported the usage of a diketopiperazine derivative, previously discovered as an inhibitor of the B. cenocepacia acyl homoserine lactone synthase CepI. The aim of this work was to decipher the CepI residues involved in the interaction with this compound to produce four mutant proteins. These mutants were tested, using enzymatic assays, in order to understand if proteins were still active. Subsequently, in order to verify the inhibitory effect of the compound, CepI mutants were tested for their activity in the presence of the inhibitor.

Burkholderia cenocepacia è un patogeno opportunista del tratto respiratorio, particolarmente problematico per i malati di fibrosi cistica. E’ difficile da eradicare a causa della sua spiccata resistenza alla maggior parte degli antimicrobici correntemente in uso in ambito clinico. Per questo motivo, è necessaria la scoperta di nuovi antimicrobici e di molecole in grado di inibire la sua virulenza. A questo proposito, il quorum sensing (QS) è un buon target per le terapie anti-virali, essendo stato associato alla produzione di vari fattori di virulenza. Nuovi composti, in grado di interferire con QS, dovrebbero essere anche in grado di bloccare la loro produzione, riducendo la capacità del batterio di colonizzare l’ospite. Inoltre, questo approccio non uccide il batterio, redendo meno probabile l’insorgere di resistenza. Tutte le specie Bcc possiedono almeno un sistema QS che consiste di un acil-omoserina-lattone (AHL) sintasi e il suo recettore AHL corrispondente. Uno dei sistemi QS di B. cenocepacia è CepIR. In questa tesi, si riporta l’uso di un derivato del composto dichetopiperazine, già noto per le sue capacità inibitorie nei confronti dell’enzima di B. cenocepacia acil-omoserina-lattone sintasi CepI. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di trovare dei residui di CepI coinvolti nell’interazione con il composto, così da poter produrre quattro proteine mutanti. Questi mutanti sono stati testati, mediante saggi enzimatici, per capire se le proteine erano ancora attive. Successivamente, per verificare l’effetto inibitorio del composto, i mutanti CepI sono stati testati per capire come cambia la loro attività in presenza dell’inibitore.