This study aims to validate the Sorbitol Dehydrogenase (SORD) depletion model in murine ex vivo retinal explants and in vitro photoreceptor cell culture (661w), and to evaluate the impact of SORD depletion on photoreceptors and retina. SORD plays a critical role in the polyol pathway, facilitating the conversion of sorbitol to fructose, following the initial conversion of glucose to sorbitol by aldose reductase (AR). Under hyperglycaemic conditions, the polyol pathway is activated, leading to sorbitol accumulation, which can cause cellular damage, particularly in photoreceptors causing retinopathy and neuropathy. It is not yet fully understood how retinopathy affects primarily diabetic patients although it seems that it is related to gene polymorphisms of some of the factors which have a role in angiogenesis including AR and SORD as well. In fact, it has been observed that AR takes part in diabetes complications especially in retinopathy as elevated levels of this enzyme are verified in the presence of excessive glucose. However, there is a growing attention in recent research regarding the involvement of SORD in the aggravation of the complications of diabetes. It has become a growing interest trying to understand the underlying pathophysiology of diabetic retinopathy and neuropathy driven by SORD. Using the ex-vivo and in vitro models, the effects of SORD gene expression inhibition on cellular viability and oxidative stress at level of photoreceptors was investigated. The experimental approaches included viability assays such as lactate dehydrogenase release (LDH) and Alamar Blue as well as immunostaining techniques for specific targets such as SORD, Visual Arrestin, 4-HNE, and 8-OHdG to assess the cellular consequences of SORD silencing. Our findings demonstrate that in the retinal explants in which SORD is silenced through adeno-associated virus (AAV8), there is greater photoreceptor degeneration. Concomitantly immunohistochemistry assay shows a reduction in the expression of Visual Arrestin in this group when compared to the control group. In the 661w photoreceptors, the absolute value of absorption at 600nm indicated a greater cell proliferation in the AAV8 transfected 661w photoreceptors. To ensure the efficacy of the SORD gene silencing in the 661w cells, immunocytochemistry assay was conducted. In fact, reduced SORD expression was observed in the AAV8 transfected photoreceptors. Consequently, to analyse the oxidative stress resulting from the SORD silencing, immunocytochemistry assay targeting 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and 4-hydroxyneonal (4-HNE) was conducted. Both targets had higher expression levels in the AAV8 transfected 661w cells when compared to the control group implicating greater oxidative stress in the SORD silenced cells. The implications of this research are critical for understanding the biochemical pathways involved in retinal degeneration and eventually peripheral motor neurons as well as for developing therapeutic strategies for both retinal diseases and distal neuropathies. Further studies are required to elucidate the precise mechanisms by which SORD influences oxidative stress and to explore potential interventions, including gene replacement therapy, that could mitigate the adverse effects of its inhibition.

Questa tesi mira a validare la deplezione della sorbitolo deidrogenasi (SORD) ex vivo in espianti retinici murini e in vitro in una linea di fotorecettori (661w), e di valutare l’impatto della deplezione di SORD sui fotorecettori e sulla retina. Il SORD è coinvolto nella via dei polioli, catalizzando la conversione del sorbitolo in fruttosio, a seguito della conversione iniziale del glucosio in sorbitolo da parte dell’AR. Condizioni iperglicemiche causano l’attivazione di questa via metabolica collaterale portando all’accumulo di sorbitolo, il quale può determinare danni cellulari, in particolare nei fotorecettori, causando retinopatia e neuropatia. Non è ancora pienamente compreso come i pazienti diabetici siano più suscettibili alla retinopatia sebbene sembri che ciò sia legato a polimorfismi genetici di alcuni fattori che hanno un ruolo nell’angiogenesi, come AR e SORD. Infatti, è stato osservato che l’AR partecipa alle complicazioni del diabete, specialmente nella retinopatia, poiché livelli elevati di questo enzima vengono verificati in presenza di eccesso di glucosio. Perciò, è diventato di crescente interesse cercare di comprendere la fisiopatologia sottostante della retinopatia diabetica e della neuropatia guidate dalla SORD. Utilizzando i modelli ex vivo e in vitro, sono stati investigati gli effetti dell’inibizione dell’espressione del gene SORD sulla vitalità cellulare e lo stress ossidativo al livello dei fotorecettori. Gli approcci sperimentali hanno incluso saggi di vitalità come il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) e Alamar Blue, nonché tecniche di immunofluorescenza per osservare l’espressività di determinati target quale SORD, Arrestina, 4-HNE, e 8-OHdG per valutare le conseguenze cellulari del silenziamento di SORD. I risultati dimostrano che negli espianti retinici in cui SORD è silenziato c’è una maggiore degenerazione di fotorecettori. Contemporaneamente il saggio di immunoistochimica mostra una riduzione dell’espressione di Arrestina rispetto al controllo. Nelle cellule 661w, il valore assoluto dell’assorbimento a 600nm ha indicato una maggiore proliferazione cellulare. Per verificare l’efficacia del silenziamento di SORD tramite il virus adeno-associato 8 (AAV8), è stato condotto un saggio di immunocitochimica. Infatti, è stata osservata una ridotta espressione di SORD nei fotorecettori che hanno ricevuto l’AAV8. Di conseguenza, per analizzare lo stress ossidativo derivante dal silenziamento, è stato condotto un saggio di immunocitochimica mirato all’8-idrossideossiguanosina (8-OHdG) e al 4-idrossineonale (4-HNE). Entrambi i target hanno mostrato livelli di espressione più elevati nelle cellule 661w che hanno ricevuto l’AAV8 rispetto al gruppo di controllo, implicando un maggiore stress ossidativo nelle cellule in cui SORD è silenziato. Le implicazioni di questa ricerca potrebbero aiutare a comprendere le vie biochimiche coinvolte nella degenerazione retinica e, eventualmente, nei neuroni motori periferici, nonché a sviluppare nuove strategie terapeutiche. Ulteriori studi sono necessari per chiarire i meccanismi precisi con sui SORD influenza lo stress ossidativo per esplorare potenziali interventi, inclusa la terapia di sostituzione genica, che potrebbero mitigare gli effetti avversi della sua inibizione.

Validazione della deplezione di Sorbitolo Deidrogenasi ex vivo in espianti retinici e in vitro in colture di fotorecettori murini

LEAKE, YANET NEGASSI
2023/2024

Abstract

This study aims to validate the Sorbitol Dehydrogenase (SORD) depletion model in murine ex vivo retinal explants and in vitro photoreceptor cell culture (661w), and to evaluate the impact of SORD depletion on photoreceptors and retina. SORD plays a critical role in the polyol pathway, facilitating the conversion of sorbitol to fructose, following the initial conversion of glucose to sorbitol by aldose reductase (AR). Under hyperglycaemic conditions, the polyol pathway is activated, leading to sorbitol accumulation, which can cause cellular damage, particularly in photoreceptors causing retinopathy and neuropathy. It is not yet fully understood how retinopathy affects primarily diabetic patients although it seems that it is related to gene polymorphisms of some of the factors which have a role in angiogenesis including AR and SORD as well. In fact, it has been observed that AR takes part in diabetes complications especially in retinopathy as elevated levels of this enzyme are verified in the presence of excessive glucose. However, there is a growing attention in recent research regarding the involvement of SORD in the aggravation of the complications of diabetes. It has become a growing interest trying to understand the underlying pathophysiology of diabetic retinopathy and neuropathy driven by SORD. Using the ex-vivo and in vitro models, the effects of SORD gene expression inhibition on cellular viability and oxidative stress at level of photoreceptors was investigated. The experimental approaches included viability assays such as lactate dehydrogenase release (LDH) and Alamar Blue as well as immunostaining techniques for specific targets such as SORD, Visual Arrestin, 4-HNE, and 8-OHdG to assess the cellular consequences of SORD silencing. Our findings demonstrate that in the retinal explants in which SORD is silenced through adeno-associated virus (AAV8), there is greater photoreceptor degeneration. Concomitantly immunohistochemistry assay shows a reduction in the expression of Visual Arrestin in this group when compared to the control group. In the 661w photoreceptors, the absolute value of absorption at 600nm indicated a greater cell proliferation in the AAV8 transfected 661w photoreceptors. To ensure the efficacy of the SORD gene silencing in the 661w cells, immunocytochemistry assay was conducted. In fact, reduced SORD expression was observed in the AAV8 transfected photoreceptors. Consequently, to analyse the oxidative stress resulting from the SORD silencing, immunocytochemistry assay targeting 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and 4-hydroxyneonal (4-HNE) was conducted. Both targets had higher expression levels in the AAV8 transfected 661w cells when compared to the control group implicating greater oxidative stress in the SORD silenced cells. The implications of this research are critical for understanding the biochemical pathways involved in retinal degeneration and eventually peripheral motor neurons as well as for developing therapeutic strategies for both retinal diseases and distal neuropathies. Further studies are required to elucidate the precise mechanisms by which SORD influences oxidative stress and to explore potential interventions, including gene replacement therapy, that could mitigate the adverse effects of its inhibition.
2023
Validation of Sorbitol Dehydrogenase depletion in murine ex vivo retinal explants and in vitro photoreceptor cell culture
Questa tesi mira a validare la deplezione della sorbitolo deidrogenasi (SORD) ex vivo in espianti retinici murini e in vitro in una linea di fotorecettori (661w), e di valutare l’impatto della deplezione di SORD sui fotorecettori e sulla retina. Il SORD è coinvolto nella via dei polioli, catalizzando la conversione del sorbitolo in fruttosio, a seguito della conversione iniziale del glucosio in sorbitolo da parte dell’AR. Condizioni iperglicemiche causano l’attivazione di questa via metabolica collaterale portando all’accumulo di sorbitolo, il quale può determinare danni cellulari, in particolare nei fotorecettori, causando retinopatia e neuropatia. Non è ancora pienamente compreso come i pazienti diabetici siano più suscettibili alla retinopatia sebbene sembri che ciò sia legato a polimorfismi genetici di alcuni fattori che hanno un ruolo nell’angiogenesi, come AR e SORD. Infatti, è stato osservato che l’AR partecipa alle complicazioni del diabete, specialmente nella retinopatia, poiché livelli elevati di questo enzima vengono verificati in presenza di eccesso di glucosio. Perciò, è diventato di crescente interesse cercare di comprendere la fisiopatologia sottostante della retinopatia diabetica e della neuropatia guidate dalla SORD. Utilizzando i modelli ex vivo e in vitro, sono stati investigati gli effetti dell’inibizione dell’espressione del gene SORD sulla vitalità cellulare e lo stress ossidativo al livello dei fotorecettori. Gli approcci sperimentali hanno incluso saggi di vitalità come il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) e Alamar Blue, nonché tecniche di immunofluorescenza per osservare l’espressività di determinati target quale SORD, Arrestina, 4-HNE, e 8-OHdG per valutare le conseguenze cellulari del silenziamento di SORD. I risultati dimostrano che negli espianti retinici in cui SORD è silenziato c’è una maggiore degenerazione di fotorecettori. Contemporaneamente il saggio di immunoistochimica mostra una riduzione dell’espressione di Arrestina rispetto al controllo. Nelle cellule 661w, il valore assoluto dell’assorbimento a 600nm ha indicato una maggiore proliferazione cellulare. Per verificare l’efficacia del silenziamento di SORD tramite il virus adeno-associato 8 (AAV8), è stato condotto un saggio di immunocitochimica. Infatti, è stata osservata una ridotta espressione di SORD nei fotorecettori che hanno ricevuto l’AAV8. Di conseguenza, per analizzare lo stress ossidativo derivante dal silenziamento, è stato condotto un saggio di immunocitochimica mirato all’8-idrossideossiguanosina (8-OHdG) e al 4-idrossineonale (4-HNE). Entrambi i target hanno mostrato livelli di espressione più elevati nelle cellule 661w che hanno ricevuto l’AAV8 rispetto al gruppo di controllo, implicando un maggiore stress ossidativo nelle cellule in cui SORD è silenziato. Le implicazioni di questa ricerca potrebbero aiutare a comprendere le vie biochimiche coinvolte nella degenerazione retinica e, eventualmente, nei neuroni motori periferici, nonché a sviluppare nuove strategie terapeutiche. Ulteriori studi sono necessari per chiarire i meccanismi precisi con sui SORD influenza lo stress ossidativo per esplorare potenziali interventi, inclusa la terapia di sostituzione genica, che potrebbero mitigare gli effetti avversi della sua inibizione.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
YANET NEGASSI LEAKE.pdf

accesso aperto

Descrizione: Validazione della deplezione di Sorbitolo Deidrogenasi ex vivo in espianti retinici e in vitro in colture di fotorecettori murini
Dimensione 2.17 MB
Formato Adobe PDF
2.17 MB Adobe PDF Visualizza/Apri

È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
Per maggiori informazioni e per verifiche sull'eventuale disponibilità del file scrivere a: unitesi@unipv.it.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/28251