Studio delle strategie di migrazione in cellule di glioblastoma multiforme umano in vitro

Il glioma è una neoplasia cerebrale di origine gliale che, pur rappresentando solo il 15% dei tumori cerebrali, è il principale tumore primario maligno negli adulti (Kleihues et al., 1995). Si tratta di un tumore caratterizzato da una forte propensione all’invasione e da un elevato tasso proliferativo che determina la compressione del tessuto sano circostante. La strategia invasiva adottata questa neoplasia prevede l’infiltrazione delle cellule tumorali al livello del parenchima cerebrale. Le uniche strategie terapeutiche tutt’ora utilizzate sono la resezione chirurgica, che ha lo scopo di rimuovere parzialmente o totalmente la massa tumorale e ridurre la pressione intracranica, la radioterapia e/o chemioterapia, che favoriscono un rallentamento della progressione ed espansione del GBM (Turner et al., 2014). È quindi necessaria una comprensione più profonda dei meccanismi molecolari che stanno alla base dell’insorgenza di questa neoplasia e in particolare di quali processi entrano in gioco nei fenomeni di migrazione cellulare, con lo scopo di sviluppare nuove strategie terapeutiche. In questa tesi vengono indagate e confrontate le strategie di migrazione che vengono assunte da due diverse linee cellulari in assenza ed in presenza di specifiche concentrazione di un farmaco chiamato Bepridil. In particolare, abbiamo utilizzato le cellule U251, che sono cellule tumorali immortalizzate spesso utilizzate per condurre questo tipo di studi, e la linea cellulare primaria GBM19 le cui cellule sono state prelevate dalla biopsia effettuata sul paziente. Il Bepridil è un farmaco che già da tempo si sta studiando nel laboratorio presso il quale ho svolto l’internato. Esso agisce a livello dello scambiatore NCX (Na+/Ca2+) che si trova a cavallo della membrana cellulare e riteniamo che questa proteina sia un valido target al fine di ridurre la motilità cellulare in quanto, tramite l’azione del farmaco, si verifica un aumento della concentrazione dello ione calcio a livello intracellulare. Le tecniche impiegate sono state molteplici, abbiamo effettuato il saggio MTT per determinare la concentrazione ottimale di farmaco da impiegare per il trattamento sulle due diverse linee cellulari, abbiamo eseguito test di Wound-Healing per osservare le diverse modalità di migrazione adottate dalle cellule e la velocità con la quale richiudevano lo scratch, abbiamo infine eseguito esperimenti di immunocitochimica per osservare in modo specifico la localizzazione e la quantità di scambiatore NCX a livello della membrana cellulare. Al termine degli esperimenti abbiamo formulato diverse ipotesi: le cellule GBM19 necessitano di una concentrazione minore di farmaco rispetto alle U251 in quanto sono cellule primarie più soggette a senescenza e di conseguenza anche più sensibili all’azione del farmaco. Queste cellule mostrano modalità di migrazioni diverse all’interno della coltura stessa in quanto ricca di cellule staminali e di conseguenza molto eterogenea, mentre, le U251 tendono a migrare longitudinalmente a chiudere lo scratch tramite l’estroflessione di lamellipodi. In seguito al trattamento con Bepridil le U251 arrestano la loro migrazione mentre, le cellule di GBM, cambiano la modalità di movimento infatti abbiamo osservato che invece di muoversi verso la chiusura dello scratch queste iniziano a muoversi parallelamente al bordo dello scratch. Alla luce delle analisi di immunocitochimica il segnale fluorescente specifico per NCX si mostra più intenso qualche ora dopo l’esecuzione dello scratch. Probabilmente, visto il ruolo centrale che questo scambiatore assume nel processo di migrazione cellulare, esso potrebbe venire maggiormente espresso in momenti specifici oppure potrebbe subire processi di rilocalizzazione da una zona della membrana cellulare verso l’estremità anteriore del lamellipodio.