CARATTERIZZAZIONE DEL FENOTIPO SCHELETRICO ADULTO IN UN MODELLO MURINO DELLA DISPLASIA DIASTROFICA

Diastrophic dysplasia (DTD) is a rare recessive chondrodysplasia caused by mutations in SLC26A2 gene, which encodes a sulfate-chloride antiporter essential for the extracellular sulfate uptake into the cell. Thus, functional impairment of this transporter leads to a reduction in the intracellular sulfate levels, resulting in proteoglycan (PG) undersulfation and alterations in the biomechanical and structural properties of cartilage tissue. Consequently, the clinical manifestations of DTD include skeletal anomalies and joint alterations, leading to early onset of cartilage damage and osteoarthritis (OA), alongside with movement difficulty and pain. To better understand the molecular basis of this pathology, a murine model of diastrophic dysplasia, the dtd mouse, was generated and then validated in our laboratory, as it reproduces the skeletal phenotype observed in affected patients. Since DTD is a progressive disease, my thesis work focused on characterizing the skeletal phenotype of adult dtd mice of both genders to study the evolution of DTD and its clinical manifestations. For this purpose, morphometric and histological analyses were performed on dtd mice of both sexes at 1, 2, and 6 months of age. Morphometric analyses confirmed a significant growth retardation in dtd mice compared to controls at all time-points, with significantly higher bone measurements in male mice compared to females of the same age. Assessment of bone quality and microarchitecture using dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) and micro-computed tomography (micro-CT) showed that bone mineral content (BMC) and density (BMD), along with trabecular and cortical bone parameters, were significantly altered in dtd mice compared to wild-type mice at all ages, regardless of the gender. Subsequently, to examine the presence of morphological anomalies in the articular cartilage, Safranin-O staining was performed on knee joint sections. The Osteoarthritis Research Society International (OARSI) score evaluation showed the presence of PG depletion in the ECM and surface irregularities in the joints of dtd mice compared to controls. Furthermore, micro-CT analysis of subchondral bone demonstrated significant alterations in dtd mice compared to wild-types for both sexes at all time-points, with significantly higher values observed in male mice compared to females only at 1 month of age. In conclusion, these results confirm the presence of alterations in bone and articular cartilage in adult dtd mice, demonstrating that the skeletal phenotype progresses similarly to patients affected by DTD.

La displasia diastrofica (DTD) è una rara condrodisplasia recessiva causata da mutazioni nel gene SLC26A2 che codifica per un antiporto solfato-cloruro essenziale per l’uptake extracellulare del solfato all’interno della cellula. Dunque, una compromissione funzionale a carico di questo trasportatore causa una riduzione dei livelli di solfato intracellulare, con conseguente sottosolfatazione dei proteoglicani (PG) e alterazioni delle proprietà biomeccaniche e strutturali del tessuto cartilagineo. Per questo, tra le manifestazioni cliniche della DTD, sono presenti anomalie scheletriche e alterazioni a carico delle articolazioni che portano all’insorgenza precoce di danno cartilagineo e osteoartrite (OA), accompagnati da difficoltà e dolore nel movimento. Per comprendere le basi molecolari della patologia, è stato generato e validato nel nostro laboratorio un modello murino della displasia diastrofica, il topo dtd, che riproduce il fenotipo patologico osservato nei pazienti affetti. Poiché è noto che la DTD è una patologia progressiva, il mio lavoro di tesi si è focalizzato sulla caratterizzazione del fenotipo scheletrico di topi dtd di entrambi i generi in età adulta, con l’obiettivo di studiare l’evoluzione della DTD e delle sue manifestazioni cliniche. A questo scopo sono state condotte analisi morfometriche e istologiche su topi dtd di entrambi i sessi, prelevati a 1, 2 e 6 mesi. Le analisi morfometriche hanno confermato un significativo ritardo nella crescita dei topi dtd rispetto ai controlli per tutti i time-point considerati, con valori relativi alla misurazione degli elementi ossei significativamente più alti nei topi maschi rispetto alle femmine della stessa età. La valutazione della qualità e della microarchitettura ossea mediante dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) e micro-computed tomography (micro-CT) ha mostrato che il contenuto e la densità minerale ossea, insieme ai parametri misurati nell’osso trabecolare e corticale, sono significativamente alterati nei topi dtd rispetto ai topi wild-type a tutte le età, indipendentemente dal sesso. Successivamente, per esaminare la presenza di anomalie morfologiche a livello della cartilagine articolare, è stata eseguita una colorazione con safranina-O su sezioni dell’articolazione del ginocchio. La valutazione dell'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) score ha mostrato una deplezione di PG nell’ECM e irregolarità superficiali nelle articolazioni dei topi dtd rispetto ai controlli. Inoltre, l’analisi micro-CT dell'osso subcondrale ha dimostrato la presenza di alterazioni significative nei topi dtd rispetto ai wild-type per entrambi i sessi a tutti i time-point, con valori significativamente più elevati osservati nei topi maschi rispetto alle femmine solo all'età di 1 mese. In conclusione, i risultati ottenuti confermano la presenza di alterazioni nell’osso e nella cartilagine articolare di topi dtd adulti, dimostrando che il fenotipo scheletrico progredisce in modo simile ai pazienti affetti da DTD.