Impatto della dieta chetogenica sulla sindrome da deficit di GLUT1: il ruolo dell'epigenetica

La sindrome da carenza di GLUT1 (GLUT1-DS) è una rara condizione neuro-metabolica, caratterizzata da epilessia farmaco-resistente. La malattia è causata da mutazioni in eterozigosi nel gene SLC2A1, che causano una riduzione dell'apporto di glucosio al cervello. La dieta chetogenica (KD), che sostituisce il glucosio con corpi chetonici come fonte di energia, si è dimostrata promettente nel trattamento, ma i meccanismi, alla base dei suoi effetti terapeutici, rimangono ancora sconosciuti. Lo studio ha l’obiettivo di identificare le vie molecolari interessate dalla KD nel trattamento della GLUT1-DS, indagando i cambiamenti epigenetici dovuti alla somministrazione della dieta. Inizialmente, è stato valutato lo stato di chetosi dei pazienti affetti in trattamento con KD mediante un’analisi metabolica, in FIA-MS/MS. Come secondo passaggio, è stata effettuata l’analisi del trascrittoma, comparando il profilo di espressione genica dei pazienti prima e dopo il trattamento. Tale analisi è stata eseguita utilizzando il kit Illumina Total RNA e il NextSeq500 e l'analisi di espressione differenziale è stata condotta utilizzando R DESeq.2 e Cluster Profiler. IsoformSwitchAnalyzeR è il tool utilizzato per l’analisi di switches e isoforme alternative. Il terzo passaggio ha visto effettuare un profilo di metilazione del DNA sequenziato su PromethION 2 Solo. Infine, la firma interferonica è stata eseguita in qPCR con il kit BM-023 (Biomole). I risultati relativi allo studio del profilo di espressione genica, come effetto della dieta, rivelano: a) cambiamenti epigenetici; b) deregolazione nel signaling dei canali ionici; c) inattivazione della risposta immunitaria correlata al segnale della cascata interferonica. Inoltre, tra gli 11 geni risultati differenzialmente espressi, 4 piccoli RNA nucleari (snRNA) hanno mostrato un decremento della regolazione dopo trattamento. Questi 4 snRNAs risultano, secondo Genecards, implicati nei meccanismi di splicing alternativo. Infatti, effettuando un’analisi di splicing sui trascritti differenzialmente espressi, si è delineato un cambiamento significativo dello splicing tra le due condizioni. L’analisi delle isoforme di splicing alternativo ha permesso di individuare 282 geni coinvolti in tali eventi, 411 eventi di splicing per la caratterizzazione di 325 isoforme alternative; a partire da una ricerca bibliografica e dal confronto tra dataset dei geni che hanno subito splicing e quelli derivanti dagli studi di deregolazione dei canali ionici, è stato evidenziato il canale P2RX7, in grado di interagire con GLUT1. Tra le 5 isoforme del gene P2RX7 identificate, quella non codificante è risultata sovraregolata dopo il trattamento. Questa aumentata espressione potrebbe alterare la trascrizione/traduzione dell’isoforma codificante P2RX7, portando in tal modo ad una sottoregolazione nel signaling dei canali ionici. La letteratura indica che lo stato infiammatorio agisce incrementando P2RX7; perciò, abbiamo ipotizzato e confermato il corrispettivo decremento della firma interferonica, correlato al decremento di P2RX7 dopo KD. In ultimo, il profilo di metilazione dei pazienti GLUT1-DS ha permesso di studiare le differenze dei livelli di metilazione nei geni dei canali ionici, evidenziando il gene P2RX1 come ipermetilato dopo trattamento. Utilizzando il tool STRING, abbiamo evidenziato che P2RX1 è in grado di interagire con l’isoforma canonica P2RX7. Occorreranno ulteriori studi per comprendere il meccanismo di interazione tra i due canali. Il lavoro di tesi evidenzia alcune vie molecolari coinvolte nel trattamento di bambini affetti da GLUT1-DS con KD, che sembra avere un effetto sull'espressione del signaling dei canali ionici, attraverso la combinazione di cambiamenti epigenetici ed eventi di splicing.