Ottimizzazione di un farmaco cellulare multi-virus specifico per il trattamento delle infezioni virali dopo trapianto

In immunocompromised patients, such as transplant recipients, recurrent infections are primarily due to reactivations of latent viruses, such as herpesviruses EBV, CMV, and HHV-6, respiratory viruses such as ADV, and polyomaviruses such as BKV. Although there is the possibility of controlling some viral diseases with specific drugs, these treatments are burdened by toxicity, and in some cases, such as BKV infection, there are no drugs that have clinical efficacy. Infusion of virus-specific T lymphocytes (VSTs) from healthy donors is a promising strategy to rapidly restore virus-specific immunity and control post-transplant infections. Currently, available VSTs are predominantly targeted against single viruses, but transplant patients can develop multiple infections. The aim of the present work was to optimize a multi-virus-specific cellular drug to simultaneously treat multiple viral infections in transplant patients. However, manufacturing a customized T cell product is limited by the timescales required to obtain the cell drug. To overcome this problem, a rapid cell activation and expansion protocol has been developed through the G-Rex bioreactor, which offers advantages compared to traditional cultures: rapid expansion of T cells, reduction of production times, minimization of the risk of contamination and high quality of the final product. Cellular products obtained via plate and bioreactor culture were compared for their phenotypic and functional characteristics, including cytotoxic potential and the ability to secrete cytokines. The specific cytotoxicity induced by CTLs was evaluated by chromium release assay, while the production of specific cytokines was tested with an ELISPOT assay which quantifies INF-γ secreted by the cells. Furthermore, the immunophenotype of the cellular products was also evaluated by flow cytometric analysis. We could observe how the optimized protocol in G-Rex allows the expansion of VST through diffusion with peptides derived from immunogenic viral proteins in the presence of homeostatic cytokines, with culture times around 10-12 days. The cells obtained in the bioreactor were at least comparable to those obtained with the classic culture method in terms of functionality, but the quality of the cells was better, as the VSTs from the bioreactor have characteristics of early memory cells, such as T stem cells memory cells, with greater survival in vivo, compared to the effectors obtained from plate cultures, which are predominantly memory effector cells, have a reduced duration. Furthermore, the cell recuperators of the bioreactor are superior to those obtained in the plate. Since the preparation protocol using G-Rex is compatible with Good Manufacturing Practices (GMP), it is possible to create a bank of multi-virus specific T lymphocytes from third-party HLA-compatible donors, not related to the patients, ensuring the immediate availability of a cellular product for the treatment of virus-related post-transplant complications.

Nei pazienti immunocompromessi, come i riceventi un trapianto, le infezioni ricorrenti sono dovute principalmente a riattivazioni di virus latenti, come gli herpesvirus EBV, CMV e HHV-6, i virus respiratori come ADV, ed i polyomavirus come BKV. Sebbene vi sia la possibilità di controllare alcune infezioni virali con farmaci specifici, questi trattamenti sono gravati da tossicità, ed in alcuni casi, come ad esempio l’infezione da BKV, non esistono farmaci che abbiano efficacia clinica. L’infusione di linfociti T virus-specifici (VST) da donatori sani è una strategia promettente per rispristinare rapidamente un'immunità virus-specifica e controllare le infezioni post-trapianto. Attualmente, i VST disponibili sono prevalentemente mirati contro singoli virus, ma i pazienti trapiantati possono sviluppare infezioni multiple. Lo scopo del presente lavoro è stato ottimizzare un farmaco cellulare multi-virus specifico per trattare simultaneamente più infezioni virali nei pazienti trapiantati. Tuttavia, la produzione di un prodotto T cellulare personalizzato è limitata dalle tempistiche necessarie ad ottenere il farmaco cellulare. Per superare questo problema, è stato sviluppato un protocollo di attivazione ed espansione cellulare rapida attraverso il bioreattore G-Rex, che offre vantaggi rispetto alle colture tradizionali: espansione rapida delle cellule T, riduzione dei tempi di produzione, minimizzazione del rischio di contaminazione e alta qualità del prodotto finale. I prodotti cellulari ottenuti tramite coltura in piastra e in bioreattore sono stati confrontati per le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali, inclusi il potenziale citotossico e la capacità di secernere citochine. La citotossicità specifica indotta dai CTL è stata valutata tramite test di rilascio del cromo, mentre la produzione di citochine specifiche è stata testata con un saggio ELISPOT che quantifica l’ INF-γ secreto dalle cellule. Inoltre, è stato valutato anche l'immunofenotipo dei prodotti cellulari tramite analisi citofluorimetrica. Abbiamo potuto osservare come il protocollo ottimizzato in G-Rex consenta l’espansione di VST attraverso la stimolazione con peptidi derivati da proteine virali immunogeniche in presenza di citochine omeostatiche, con tempi di coltura intorno ai 10-12 giorni. Le cellule ottenute in bioreattore erano almeno paragonabili a quelle ottenute con la metodica colturale classica in termini di funzionalità, ma la qualità delle cellule è risultata migliore, in quanto i VST da bioreattore hanno caratteristiche di cellule early memory, come le cellule T stem cell memory, dotate di maggior sopravvivenza in vivo, rispetto agli effettori ottenuti da colture in piastra, che sono prevalentemente cellule effector memory, a durata ridotta. Inoltre, i recuperi cellulari da bioreattore sono superiori a quelli ottenuti in piastra. Dato che il protocollo di allestimento tramite G-Rex è compatibile con le pratiche di Good Manufacturing Practices (GMP), è possibile creare una banca di linfociti T multi-virus specifici da donatori HLA-compatibili di parte terza, ovvero non correlati ai malati, garantendo la disponibilità immediata di un prodotto cellulare per il trattamento delle complicanze virus-correlate post-trapianto.