The DNA Polymerase λ: a dual study on its self-regulation during NHEJ and exploiting its mutants as a tool for site-specific genomic ribonucleotide enrichment.

This thesis focuses on two aspects inherent to DNA Polymerase λ, analyzing its autoregulatory mechanisms during Non-Homologous End-Joining (NHEJ), and exploring the use of its mutants as tools to incorporate ribonucleotides into the genome. The first part of the thesis investigates how Ku70/80 regulates the activity of DNA polymerase λ by promoting its interaction with DNA ends and promoting its polymerase activity while preventing its nonspecific activation. The second part introduces the design, cloning and analysis of two Pol λ mutants. The Pol λY505G/F506W mutant was compared with Pol λΔLoop1, which has been previously characterized in the literature, to evaluate its ability to insert ribonucleotides into the genome so that it could be used for the generation of a new site-specific genome editing tool. Both mutants demonstrated altered specificity for ribonucleotides, proving suitable for the generation of a new genome editing tool. Overall, this thesis focuses on DNA polymerase λ, understanding its role in ensuring genome stability and presenting innovative approaches for using it as a tool for targeted genomic editing.

Questa tesi si concentra su due aspetti inerenti alla DNA Polimerasi λ, analizzandone i meccanismi di autoregolazione durante il Non-Homologous End-Joining (NHEJ), ed esplorando l’utilizzo di suoi mutanti come strumenti per incorporare ribonucleotidi nel genoma. La prima parte della tesi indaga come Ku70/80 regoli l'attività della DNA polimerasi λ promuovendo la sua interazione con le estremità del DNA e promovendo la sua attività polimerasica e prevenendone al contempo l'attivazione aspecifica. La seconda parte introduce il design, clonaggio e analisi di due mutanti di Pol λ. Il mutante Pol λY505G/F506W è stato confrontato con la Pol λΔLoop1, già precedentemente caratterizzata in letteratura, per valutare la sua capacità di inserire ribonucleotidi nel genoma, così da poterla utilizzare per la generazione di un nuovo strumento di modifica del genoma sito-specifico. Entrambi i mutanti hanno dimostrato un'alterata specificità per i ribonucleotidi, dimostrandosi adatte alla generazione di un nuovo strumento di editing genomico. Nel complesso, questa tesi si concentra sulla DNA polimerasi λ, comprendendo il suo ruolo nel garantire la stabilità del genoma e presentando approcci innovativi per utilizzarla come strumento per modifiche genomiche mirate.