Una singola sostituzione di un amminoacido nella proteina legante la fibronectina A (FnBPA) di Staphylococcus aureus riduce significativamente la reticolazione con il fibrinogeno mediata dal fattore XIII attivato.

Staphylococcus aureus is a Gram-positive, highly adaptable human pathogen known to trigger community-acquired and hospital-acquired diseases. Clinical severity ranges from mild skin infections, including impetigo and folliculitis, through endocarditis, pneumonia, and sepsis, up to the highly life-threatening conditions of toxic shock syndrome. The fast emergence of antibiotic-resistant strains has been seen with methicillin-resistant S. aureus and vancomycin-resistant S. aureus, hence complicating the treatment processes. This demands the discovery of new treatment options by developing novel therapeutic strategies and vaccinations. A wide variety of S. aureus virulence factors can be produced to avoid the action of host immune components and includes up to 24 cell wall-anchored and secreted proteins, including activators of host proteases, which are key factors in pathogenesis. One such activator is von Willebrand Factor Binding Protein (vWbp). The first description of vWbp was as a result of its interaction with human von Willebrand factor (vWF), but it binds other host ligands including prothrombin, factor XIII (FXIII), and fibronectin (FN). Fibrinogen (Fbg) is an important glycoprotein found in blood plasma, associated with blood coagulation and wound healing. During clotting, it is converted to fibrin when acted upon by thrombin to form a mesh that physically shuts off the flow of blood and acts to brace the site of the wound. In the case of S. aureus infections, Fbg is a crucial target because the bacteria hijack it to be able to adhere to host tissues and facilitate colonization that enables them to immune evade. This interaction is important in establishment and persistence of infection, by which bacteria bind to Fbg through specific receptors that enhance their pathogenicity, leading to disease causation.Motta et al. 2023 demonstrated that vWbp derived from S. aureus activates transglutaminases, specifically FXIII, to create covalent cross-links between FnBPA and Fbg. Specifically, FXIII catalyses the formation of high molecular weight covalent heteropolymers between the N1 domain of FnBPA and the α-chain of Fbg. Based on similar evidence, the results of Motta et al. suggested that these cross-links enhance this pathogen's adherence and persistence within host tissues, contributing to S. aureus virulence. Further investigation suggested that the glutamine residue at position 103 (Q103) in the N1 subdomain of FnBPA was directly involved in the formation of cross-links with Fbg. The aim of my thesis was therefore to evaluate the effect of the Q103A mutation on the protein's ability to form covalent cross-links with Fbg Recombinant DNA constructs were made with pQE30 and then expressed in Escherichia coli strains. Affinity chromatography was used to purify the proteins. The proteins were then checked for their presence and functionality using colony PCR and Western blot analysis. ELISA assays were performed to quantitatively assess the binding interaction and cross-link formation between the FnBPA variants and Fbg,the results clearly indicates that substitution Q103A reflected a change in the covalent cross-linking with Fbg, as suggested by reduced cross-linking within the Western blot assays, but gave similar binding affinity for Fbg in the ELISA assays. The results show that Q103 has an important role in the process of cross-linking, one of the main mechanisms of S. aureus adhesion to and evasion of host immunity. The research is done to reveal specific molecular interactions mediated via the cross-linking activity of FnBPA to Fbg and contributes towards an understanding of the process of pathogenicity, by which identification of potential targets for therapeutic intervention might be helpful to prevent this bacterial attachment and persistence in tissue. This work extends Motta et al.'s understanding of FnBPA, offering new insights into strategies to prevent S. aureus infections.

Staphylococcus aureus è un patogeno umano Gram-positivo, altamente adattabile, noto per causare malattie acquisite in comunità e ospedali. La gravità clinica varia da infezioni cutanee lievi, come impetigine e follicolite, a endocardite, polmonite e sepsi, fino a condizioni altamente letali come la sindrome da shock tossico. La rapida comparsa di ceppi resistenti agli antibiotici, come S. aureus resistente alla meticillina e alla vancomicina, complica i processi di trattamento, richiedendo la scoperta di nuove opzioni terapeutiche e vaccinali. Staphylococcus aureus produce una varietà di fattori di virulenza per sfuggire ai componenti immunitari dell'ospite, tra cui fino a 24 proteine ancorate alla parete cellulare e secrete, inclusi attivatori delle proteasi dell'ospite, fattori chiave nella patogenesi. Uno di questi attivatori è la Proteina Legante il Fattore di von Willebrand (vWbp). Inizialmente descritta per la sua interazione con il fattore di von Willebrand (vWF) umano, vWbp si lega ad altri ligandi dell'ospite, tra cui protrombina, fattore XIII (FXIII) e fibronectina (FN). Il fibrinogeno (Fbg) è una glicoproteina importante presente nel plasma sanguigno, associata alla coagulazione del sangue e alla guarigione delle ferite. Durante la coagulazione, viene convertito in fibrina dall'azione della trombina, formando una rete che chiude fisicamente il flusso sanguigno e rafforza il sito della ferita. Nel contesto delle infezioni da S. aureus, Fbg è un bersaglio cruciale, poiché i batteri lo sfruttano per aderire ai tessuti dell'ospite, facilitando la colonizzazione e l'evasione immunitaria. Questa interazione è fondamentale per l'instaurarsi e il persistere dell'infezione, con i batteri che si legano a Fbg tramite recettori specifici che ne potenziano la patogenicità, causando malattia. Motta et al. 2023 hanno dimostrato che vWbp derivato da S. aureus attiva le transglutaminasi, in particolare FXIII, per creare legami covalenti tra FnBPA e Fbg. FXIII catalizza la formazione di eteropolimeri covalenti ad alto peso molecolare tra il dominio N1 di FnBPA e la catena α di Fbg. I risultati di Motta et al. suggeriscono che questi legami migliorano l'adesione del patogeno e la sua persistenza nei tessuti dell'ospite, contribuendo alla virulenza di S. aureus. Ulteriori indagini hanno indicato che il residuo di glutammina in posizione 103 (Q103) nel sottodominio N1 di FnBPA è direttamente coinvolto nella formazione di legami con Fbg. L'obiettivo della mia tesi è stato quindi valutare l'effetto della mutazione Q103A sulla capacità della proteina di formare legami covalenti con Fbg. Sono stati realizzati costrutti di DNA ricombinante con pQE30, successivamente espressi in ceppi di Escherichia coli. Le proteine sono state purificate mediante cromatografia di affinità e verificate tramite PCR su colonie e analisi Western blot. Sono stati condotti saggi ELISA per valutare quantitativamente l'interazione di legame e la formazione di legami tra le varianti di FnBPA e Fbg. I risultati indicano chiaramente che la sostituzione Q103A ha comportato una riduzione del cross-linking con Fbg, come suggerito dai minori legami covalenti osservati nelle analisi Western blot, mantenendo tuttavia una simile affinità di legame per Fbg nei saggi ELISA. I risultati dimostrano che Q103 svolge un ruolo cruciale nel processo di cross-linking, uno dei principali meccanismi di adesione e evasione immunitaria di S. aureus. La ricerca contribuisce a rivelare le interazioni molecolari specifiche mediate dall'attività di cross-linking di FnBPA su Fbg, fornendo una comprensione del processo di patogenicità e identificando potenziali bersagli per interventi terapeutici volti a prevenire l'adesione e la persistenza di questo batterio nei tessuti. Questo lavoro rappresenta un'estensione degli studi di Motta et al., fornendo nuove intuizioni sulle strategie per prevenire le infezioni da S. aureus.