Caratterizzazione delle interazioni molecolari tra CypB e LH1/PLOD1 e la loro rilevanza per la corretta biosintesi del collagene

Collagen represents approximately one third of all proteins in the human body and is the most abundant protein in the extracellular matrix (ECM). ECM is the primary component of connective tissues and provides the framework for organ development and homeostasis. Cyclophilin B (CypB) is a prolyl peptidyl cis-trans isomerase whose activity is crucial for the correct maturation of collagen, where it acts as a molecular chaperone catalyzing an important step enabling folding of the collagen triple helix. Another key enzyme involved in this process is LH1/PLOD1, which is one of the three isoforms of lysyl hydroxylases (LHs, also known as procollagen, 2-oxoglutarate dioxygenases or PLOD), a family of multifunctional enzymes that catalyze the hydroxylation and subsequent glycosylation of collagen lysine residues. Despite extensive research on CypB and LH enzymes and their pivotal importance in collagen biosynthesis, a significant gap in our understanding of their enzymatic mechanisms and functions is still present. In this work, we investigated and preliminarily quantified the direct molecular interactions between CypB and LH1. Previously published work reported on possible interactions between these two enzymes. The results were obtained through a pull-down assay, but without clear evidence for direct protein-protein interaction. Using recombinant protein production and biophysical assays, we confirmed that these proteins directly bind to each other, exhibiting binding affinity in the low micromolar range. This result strengthens the hypothesis that LH1 and CypB cooperate to properly act on collagen substrates, facilitating their maturation. Collectively, results from this work pave the way to a better understanding of the biological functions of LH1 and CypB, laying the foundations for extensive structure-function studies of CypB and LH molecular ensembles.

Il collagene rappresenta circa un terzo di tutte le proteine del corpo umano ed è la proteina più abbondante della matrice extracellulare (ECM). L'ECM è il componente principale dei tessuti connettivi e fornisce le fondamenta per lo sviluppo e l'omeostasi degli organi. La ciclofilina B (CypB) è una prolil peptidil cis-trans isomerasi la cui attività è cruciale per la corretta maturazione del collagene, in quanto agisce come un chaperone molecolare che catalizza il fondamentale processo di ripiegamento della tripla elica del collagene. In processi correlati, un altro enzima chiave è LH1/PLOD1, una delle tre isoforme delle lisil idrossilasi (LH, anche note come procollagene-lisil 2-oxoglutarato diossigenasi, PLOD), una famiglia di enzimi multifunzionali che catalizzano l'idrossilazione e la successiva glicosilazione dei residui di lisina nelle molecole di collagene. Nonostante le numerose ricerche su CypB e LH e i loro fondamentali ruoli nella biosintesi del collagene, rimane una lacuna significativa nella comprensione dei loro meccanismi enzimatici e delle loro funzioni. Questo lavoro di tesi include l’identificazione ed una prima caratterizzazione quantitativa di interazioni dirette tra CypB e LH1. Dati precedenti, suggerivano possibili interazioni tra queste due proteine attraverso saggi di pull-down, tuttavia non era stata ancora dimostrata un'interazione diretta. Utilizzando una combinazione di tecniche per la produzione in forma ricombinante di queste proteine e saggi biofisici abbiamo confermato che queste proteine si legano direttamente l'una all'altra, con un'affinità nell'intervallo del basso micromolare. Questo risultato rafforza l'ipotesi che LH1 e CypB cooperino per funzionare correttamente su sustrati collagenici, permettendone la maturazione. Nel complesso, i risultati ottenuti con questo lavoro aprono la strada a una migliore comprensione delle funzioni biologiche di CypB e LH1,ponendo le basi per futuri studi strutturali e funzionali sui complessi molecolari tra CypB e gli enzimi LH.