Valutazione del metabolismo energetico del muscolo scheletrico in volontari sani: sviluppo e applicazione di una nuova pipeline di analisi 31P-MRS

The impairment of muscle energy metabolism reduces individual quality-of-life and increases healthcare costs. Phosphorus magnetic resonance spectroscopy (31P-MRS) provides useful insights into energy metabolism: e.g. providing information on oxidative capacity via the time constant τPCr, which reflects how quickly phosphocreatine (PCr), an energy buffer in skeletal muscle, recovers after exercise through the aerobic metabolic pathway. Since oxidative capacity typically decreases with age and in neuromuscular disorders (NMDs), τPCr could serve as a valuable biomarker to monitor disease progression. Before τPCr can be used in patient populations, however, it is important to ensure that it is reliable, repeatable, and reproducible in healthy volunteers. The objectives of this project were: 1) to implement an open-source pipeline for analysing data acquired with 31P-MRS both at rest and dynamically, 2) to test the noise sensitivity of fitting methods for the dynamic protocol, and 3) to characterise the variability of τPCr in vivo, along the length of the vastus lateralis (VL) muscle of the thigh, as well as across different subjects. The analysis pipeline was implemented using FSL-MRS, an open-source software package. This software includes a two-dimensional (2D) fitting function that fits a time series of spectra simultaneously and also represents a novel approach for fitting τPCr as opposed to the two-step conventional method. The noise-sensitivity of these two methods was determined via Monte Carlo (MC) analysis on simulated PCr recovery data. The best method was applied in the analysis of in vivo data, acquired in the VL muscle of healthy volunteers using a 3 tesla MRI scanner. To measure functional parameters, fully-relaxed resting 31P-MRS was performed, followed by a dynamic pulse-acquire acquisition. Two distinct exercise protocols were evaluated (ankle weight and ballistic). The implemented Python pipeline enabled the quantification of resting metabolite ratios, pH, and τPCr. MC analysis revealed that the FSL- MRS 2D fitting results in lower accuracy and precision compared to the conventional two-step method. The analysis of in vivo 31P-MRS data suggested that inter-individual variability is the dominant source of variance in the healthy VL muscle, rather than intra-muscle variability. The observed mean values of resting metabolite ratios agreed with those reported in previous studies when the age of the subjects was considered, though the mean pH (6.95) was lower than expected (7.00). In vivo testing of the implemented pipeline in the VL showed that only the ballistic exercise protocol produced sufficient PCr breakdown (≈ 35%) without inducing fatigue. With this, no pattern of variation in τPCr was observed along the VL muscle. The 31P-MRS pipeline and preliminary data on intra-muscular, inter- individual variability shown here represent a first step towards improved reproducibility. A next, more-comprehensive phase, with repeated measurements in multiple subjects and research centres, is now being planned. This will allow the evaluation of the repeatability and reproducibility of the pipeline, as well as the assessment of normative (i.e. reference) values and inter- and intra-muscular differences in healthy volunteers in different muscles, ultimately allowing future comparisons with older adults and NMD patients.

La compromissione del metabolismo energetico muscolare riduce la qualità di vita del singolo individuo e aumenta i costi sanitari. La spettroscopia di risonanza magnetica del fosforo (31P-MRS) fornisce informazioni utili sul metbolismo energetico: ad es. sulla capacità ossidativa attraverso la costante di tempo τPCr, che riflette la velocità con cui la fosfocreatina (PCr), una riserva di energia del muscolo schelettrico, viene rigenerata dopo l’esercizio attraverso la via metabolica aerobica. Siccome la capacità ossidativa tendenzialmente diminuisce con l’età e nei disturbi neuromuscolari (NMDs), la τPCr potrebbe rappresentare un valido biomarker per monitore la progressione della malattia. Prima di usarla nei pazienti è però necessario avere la garanzia che sia affidabile, ripetibile e riproducibile nei volontari sani. Gli obbiettivi di questo progetto erano:1) implementare una pipeline open-source per l'analisi dei dati acquisiti con la 31P-MRS sia a riposo che in modo dinamico, 2) testare la sensibilità al rumore dei metodi di fit per il protocollo dinamico, e 3) caratterizzare la variabilità della τPCr in vivo sia lungo la lunghezza del muscolo vasto laterale (VL) della coscia che tra soggetti diversi. La pipeline di analisi utilizza FSL-MRS, un pacchetto softwere open-source. Questo softwer include una funzione di fit bi-dimensionale (2D) che è in grado di fare il fit di tutti gli spettri di una serie temporale simultanemente e che rappresenta anche un nuovo approccio per quantificare la τPCr in contrapposizione al metodo convenzionale a due fasi. La sensibilità al rumore di questi due metodi è stata determinata mediante analisi Monte Carlo (MC) su dati simulati del recupero della PCr. Il metodo migliore è stato poi applicato nell’analisi dei dati in vivo, i quali sono stati acquisiti nel muscolo VL di volontari sani con uno scanner MRI da 3 tesla. Per misurare i parametri funzionali, è stata eseguita una 31P-MRS a riposo completamente rilassata, seguita da un'acquisizione dinamica con acquisizione ad impulso. Sono stati valutati due protocolli di esercizio (peso alla caviglia e balistico). La pipeline implementata in Python ha permesso di quantificare i rapporti dei metaboliti a riposo, il pH e la τPCr. L'analisi MC ha rivelato che il fitting 2D di FSL-MRS ha un'accuratezza e una precisione inferiori rispetto al metodo convenzionale a due fasi. L’analisi dei dati 31P-MRS in vivo suggerisce che è la variabilità interindivuduale, e non quella intramuscolare, la fonte dominante di varianza nel muscolo VL sano. Se si considera l’età dei volontari, i valori medi osservati dei rapporti dei metaboliti a riposo concordavano con quelli riportati in letteratura, mentre il pH medio osservato (6.95) era inferiore a quello atteso (7.00). Le prove in vivo della pipeline sul muscolo VL hanno mostrato che solo il protocollo di esercizio balistico ha prodotto una sufficiente degradazione della PCr (≈ 35%) senza indurre affaticamento. Con questo, non è stato osservato alcun schema di variazione della τPCr lungo il muscolo VL. La pipeline 31P-MRS e i dati preliminari sulla variabilità intramuscolare e interindividuale qui presentati rappresentano un primo passo verso una migliore riproducibilità. Si sta ora pianificando una fase successiva, più completa, con misurazioni ripetute in più soggetti e centri di ricerca. Ciò consentirà di valutare la ripetibilità e la riproducibilità della pipeline, nonché di valutare i valori normativi (i.e. di riferimento) e le differenze inter- e intra-muscolari in volontari sani e in muscoli diversi, consentendo infine futuri confronti con adulti anziani e pazienti NMD.