Sviluppo e applicazione di un metodo in-capillary CE-DAD per lo screening dell’attività inibitoria di estratti vegetali nei confronti dell’enzima acetilcolinesterasi

The acetylcholinesterase enzyme (AChE) has an important role in neurodegenerative diseases research, particularly in relation to Alzheimer’s disease. The research of new potential AChE inhibitors in natural extracts could encourage the drug discovery process of new molecules. In this thesis project an online in-capillary electrophoresis screening method, combined with UV-Vis detection, using the electrophoretically mediated microanalysis (EMMA) technique, is developed. To enhance specificity in the determination of anti-acetylcholinesterase activity the hydrolysis reaction, operated by AChE enzyme, is combined with the reaction of Ellman’s reagent, 5,5'-dithiobis-2,2'-nitrobenzoic acid. The product of the reaction, 2-nitro-5-thiobenzoic acid anion, as matter, is selectively detected at 412 nm. A reference inhibitor, neostigmine, is used to prove, if the developed method allows to identify the inhibition of AChE enzyme. The IC50 and Ki values are determined by subsequent injections of acetylthiocholine substrate, in the presence of: neostigmine at increasing concentrations, the enzyme and Ellman’s reagent. As the purpose of this thesis project is the development of a method suitable to determine the inhibitory activity of natural extracts, the method is applied to the analysis of edible plants extracts, whose anti-acetylcholinesterase activity has been described in literature: Diospyros kaki, Castanea sativa, Beta vulgaris, Aloysia citrodora, Rosa canina and Artemisia abrotanum. Each extract shows anti-acetylcholinesterase activity, expressed as inhibitory percentage, in the range 38% - 75%. These results demonstrate the possibility to identify phytotherapic agents with potential applications in the treatment of neurodegenerative diseases. In addition, the inhibitory power of Butomus umbellatus leaves extract, whose anti- acetylcholinesterase activity has not been described in literature yet, is determined. The proposed method has high selectivity, is simple and rapid; for these reasons the method is suitable for the starting screening phase, during the drug discovery process, to discover the potential anti-acetylcholinesterase activity of natural extract.

L’ enzima acetilcolinesterasi (AChE) ricopre un ruolo fondamentale nella ricerca sulle malattie neurodegenerative, in particolare è coinvolto nei meccanismi responsabili della malattia di Alzheimer. In questo ambito, la ricerca di nuovi potenziali inibitori dell’enzima AChE da estratti di origine vegetale, potrebbe dare impulso al processo di drug discovery nell’individuazione di nuove molecole. In questo progetto di tesi è stato messo a punto un metodo di screening, mediante la tecnica dell’elettroforesi capillare online in-capillary accoppiata a rivelazione UV-Vis, nella modalità electrophoretically mediated microanalysis (EMMA). Per ottenere un metodo specifico per la determinazione dell’attività anti-acetilcolinesterasica, si è scelto di accoppiare alla reazione di idrolisi, operata dall’enzima AChE nei confronti del substrato acetiltiocolina, la reazione con il reattivo di Ellman, acido 2,2’-dinitro-5,5’-ditiobenzoico. Il prodotto della reazione, anione dell’acido 2-nitro-5-tiobenzoico, infatti, è stato rivelato in modo selettivo alla lunghezza d’onda di 412 nm. Per valutare se il metodo messo a punto consenta di identificare l’inibizione dell’enzima acetilcolinesterasi, è stato impiegato il composto neostigmina, un inibitore di riferimento. Sono stati determinati il valore della costante di inibizione (Ki) e il valore della concentrazione inibente (IC50), attraverso l’iniezione in successione del substrato acetiltiocolina, in presenza di concentrazioni crescenti di inibitore, dell’enzima AChE e del reattivo di Ellman. Poiché lo scopo del lavoro è ottenere un metodo adatto allo screening dell’attività inibitoria di estratti di origine vegetale, il metodo sviluppato è stato applicato all’analisi di estratti, derivati da piante edibili appartenenti alla flora italiana autoctona, la cui attività anti-acetilcolinesterasica è stata descritta in letteratura: Diospyros kaki, Castanea sativa, Beta vulgaris, Aloysia citrodora, Rosa canina e Artemisia abrotanum. I risultati ottenuti, che in termini di percentuale di inibizione variano tra il 38% e il 75%, sono promettenti, infatti, si potrebbero identificare agenti fitoterapici che possano potenzialmente essere impiegati nel trattamento delle malattie neurodegenerative. È, inoltre, stato identificato il potere inibitorio dell’estratto di foglie di Butomus umbellatus, la cui attività anti-acetilcolinesterasica non è ancora stata descritta in letteratura. Il metodo proposto è altamente selettivo, rapido e semplice, per questo risulta adatto nella fase iniziale di screening del processo di drug discovery, per individuare la potenziale attività inibitoria di estratti di origine vegetale.