Caratterizzazione funzionale delle RNA elicasi DEAD-box DDX5 e DDX3X in diversi processi di traduzione dell'RNA

DEAD-box proteins are human RNA helicases involved in almost all steps of RNA metabolism; therefore, due to their activity they are often associated with various processes in the regulation of translation and maintenance of genomic stability. Indeed, these proteins are often implicated in tumour development or suppression as well as in the support or inhibition of viral replication. During my thesis project, we purified DDX5 and tested its activity with in vitro helicase and nuclease assays to evaluate the processing of RNA-DNA hybrids by the latter. Subsequently, we showed that there is a cooperation between DDX5 and the RNaseH2 enzyme in this process. In the second part of the project, we focused on the role of the DDX3X protein in the translation of the mTOR gene, with a focus on cap-independent translation, in situations of endoplasmic reticulum stress or viral infection by Sendai Virus. In this regard, we showed that DDX3X is crucial in this process and that stress at the endoplasmic reticulum causes an increase. In addition, we used a bioinformatics tool capable of using aligned ribosome profiling data to assess the presence and the regulation of uORFs in the 5'UTR regions of transcripts presenting them. In addition, this tool was also used to assess the translation levels of the mTOR coding region under these conditions. The results of this study showed that mTOR translation is in general negatively regulated by DDX3X, although cap-independent translation is favoured by the latter protein. Furthermore, we reported that in the early phase of Sendai virus infection mTOR is better translated than in controls and at a later stage of infection

Le proteine DEAD-box sono RNA elicasi umane coinvolte in quasi tutti gli step del metabolismo dell'RNA; pertanto, per la loro attività sono spesso associate a diversi processi nella regolazione della traduzione e nel mantenimento della stabilità genomica. Infatti, queste proteine, sono spesso implicate nello sviluppo o nella soppressione tumorale così come nel sostegno o inibizione della replicazione virale. Durante il mio progetto di tesi, abbiamo purificato DDX5 e testato la sua attività con saggi di elicasi e nucleasi in vitro per valutare il processamento di ibridi RNA-DNA da parte di quest'ultima. Successivamente, abbiamo dimostrato che esiste una cooperazione tra DDX5 e l'enzima RNaseH2 in questo processo. Nella seconda parte del progetto, invece, ci siamo concentrati sul ruolo della proteina DDX3X nella traduzione del gene mTOR, con una particolare attenzione alla traduzione cap-indipendente, in situazioni di stress al reticolo endoplasmatico o infezioni virali da parte di Sendai Virus. In questo frangente, abbiamo dimostrato che DDX3X è cruciale in questo processo e che lo stress al reticolo endoplasmatico ne causa un aumento. Inoltre, abbiamo utilizzato un tool bioinformatico in grado di utilizzare dati allineati di ribosome profiling per valutare la presenza e la regolazione uORF nelle regioni 5'UTR dei trascritti che le presentano. Inoltre, questo strumento è stato utilizzato anche per valutare i livelli di traduzione della regione codificante di mTOR in queste condizioni. I risultati di questo studio hanno dimostrato che la traduzione di mTOR è in generale negativamente regolata da DDX3X, nonostante la traduzione cap-indipendente sia favorita da quest'ultima proteina. Inoltre, abbiamo riportato che nella fase precoce dell'infezione da Sendai virus mTOR è maggiormente tradotto rispetto ai controlli e a una fase più tardiva dell'infezione.