Utilizzo di oligonucleotidi antisenso per il trattamento di varianti criptiche nel gene SDCCAG8: un possibile approccio terapeutico per la sindrome di Senior-Løken

The use of next-generation sequencing has led to significant progress in the diagnosis of rare genetic diseases (RGDs). In the diagnostic field the technology most widely used is whole-exome sequencing (WES). However, about 40-60% of RGD patients remain undiagnosed. This “missing inheritance” is, at least in part, due to the characteristics of WES, a technology that allows only the coding portion of the human genome, corresponding to about 2%, to be sequenced. This limits/does not allow the detection of so-called “cryptic variants,” i.e., noncoding variants that may affect the splicing process or alter the proper regulation of gene expression. In addition, we must remember that only 5% of RGD patients have a treatment option available due to a very limited market. In recent years, thanks to innovative precision medicine approaches, it has been possible to modulate, if not even correct, cryptic variants associated with splicing abnormalities through the use of antisense oligonucleotides (ASOs), with important therapeutic implications for the RGD patient. Indeed, ASO molecules capable of regulating exon exclusion or inclusion and consequently altering splicing patterns (ssASOs) have been successfully developed and marketed for RGDs such as Duchenne muscular dystrophy (DMD) and spinal muscular atrophy (SMA). The goal of my thesis was to develop and test ssASO as a therapeutic option for Senior-Løken syndrome (SLS), a rare ciliopathy characterized by retinal dystrophy and nephronophthisis and associated with recessive loss-of-function mutations in the SDCCAG8 gene. We identified by genome-wide analysis (WGS) two siblings with SLS who are carriers, in compound heterozygosity, of two cryptic variants located in intron 7, 267 and 288 nucleotides downstream of exon 7 of the SDCCAG8 gene, respectively (NM_006642: c.740+267C>T; c.740+288G>C). As a first step, the pathogenicity of the two noncoding variants was validated by in vitro assays on patient RNA, showing that both alter splicing modulation by generating the inclusion in the mature messenger of a 112-bp intronic portion (pseudoexon, ψ7a). As a therapeutic strategy, we designed and tested four ssASO molecules capable of masking the cryptic splicing acceptor site activated by the two variants. These molecules were tested on patient fibroblasts. The results obtained show that two of the four ssASOs tested restore physiological splicing, paving the way toward the development of personalized therapy for this family. Overall, the project corroborates the importance of paying attention to the noncoding portion of the genome in order to identify cryptic variants and improve the diagnostic rate in rare genetic diseases. Ultimately, achieving a diagnosis is the first step toward the development of innovative therapies in the context of precision medicine.

L’utilizzo del sequenziamento di nuova generazione ha portato ad un significativo progresso nella diagnosi di malattie genetiche rare (MGR). La tecnologia ad oggi più utilizzata in ambito diagnostico è il sequenziamento dell’intero esoma (WES). Tuttavia, circa il 40-60% dei pazienti affetti da MGR rimane senza una diagnosi. Questa “ereditarietà mancante” è, almeno in parte, dovuta alle caratteristiche del WES, tecnologia che permette di sequenziare esclusivamente la porzione codificante del genoma umana, corrispondente a circa il 2%. Questo limita/non permette la rilevazione delle cosiddette “varianti criptiche”, ossia varianti non codificanti che possono influenzare il processo di splicing o alterare la corretta regolazione dell’espressione dei geni. In aggiunta, dobbiamo ricordare che solo per il 5% dei pazienti affetti da MGR è disponibile un’opzione terapeutica a causa di un mercato molto limitato se non addirittura individuale. Negli ultimi anni, grazie ad approcci innovativi di medicina di precisione, è stato possibile modulare, se non addirittura correggere, varianti criptiche associate ad anomalie dello splicing grazie all’utilizzo di oligonucleotidi antisenso (ASO), con importanti ricadute terapeutiche sul paziente affetto da MGR. Infatti, molecole ASO in grado di regolare l’esclusione o inclusione degli esoni e di conseguenza modificare i pattern di splicing (ssASO) sono state sviluppate con successo e lanciate sul mercato per MGR quali la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e l’atrofia muscolare spinale (SMA). L’obiettivo della mia tesi è stato quello di sviluppare e testare ssASO come opzione terapeutica per la sindrome di Senior-Løken (SLS), una ciliopatia rara caratterizzata da distrofia retinica e nefronoftisi e associata a mutazioni recessive da perdita di funzione nel gene SDCCAG8. Abbiamo identificato mediante analisi del genoma (WGS) due fratelli affetti da SLS portatori, in eterozigosi composta, di due varianti criptiche posizionate nell’introne 7, rispettivamente a 267 e 288 nucleotidi a valle dell’esone 7 del gene SDCCAG8 (NM_006642: c.740+267C>T; c.740+288G>C). In prima battuta, la patogenicità delle due varianti non codificanti è stata validata mediante saggi in vitro sull’ RNA dei pazienti, dimostrando che entrambe alterano la modulazione dello splicing generando l’inclusione nel messaggero maturo di una porzione intronica di 112 bp (pseudoesone, ψ7a). Come strategia terapeutica, abbiamo disegnato e testato quattro molecole ssASO in grado di mascherare il sito accettore criptico di splicing attivato dalle due varianti. Tali molecole sono state testate sui fibroblasti dei pazienti. I risultati ottenuti evidenziano come due dei quattro ssASO testati ripristinino lo splicing fisiologico, aprendo la strada verso lo sviluppo di una terapia personalizzata per questa famiglia. In generale, il progetto corrobora l’importanza di attenzionare la porzione non codificante del genoma, al fine di identificare varianti criptiche e migliorare il tasso diagnostico nelle malattie genetiche rare. In ultimo, il raggiungimento di una diagnosi rappresenta il primo passo verso lo sviluppo di innovative terapie nel contesto della medicina di precisione.