Comprendere la “crisi acuta sintomatica secondaria a encefalite autoimmune”: un nuovo approccio sperimentale in vitro

Seizures frequently occur in Autoimmune Encephalitis (AE), but the factors underlying their development have not been fully identified. Auto-Abs, indeed, can account for the synaptic dysfunction, but only incompletely explain the generation of seizures that does not invariably occur in all the AE patients sharing the same auto-Ab, and can occur even in AE-seronegative cases. We investigated the specific role of AE patients –derived peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in initiating brain inflammation and seizure-like events (SLEs) occurrence. We used the in vitro guinea pig brain preparation (de Curtis, 2016; PMID: 25843067) to evaluate the effects of co-perfusion of human recombinant serum albumin with AE-derived immuno-inflammatory mediators (PBMC’s secretome) on seizure occurrence and brain inflammation. Blood samples were collected from healthy volunteers and from AE with seizures patients. hPBMCs were cultured in a standard medium for 6 hours and then perfused in the isolated brain preparation via arterial system. Healthy subjects- and AE patients-derived sera and PBMCs- derived supernatants at t0 at t6, were analyzed by Multiplex Array System for inflammatory mediators detection. Morphological analysis of GFAP- and Iba1-positive glial cells were also performed. Arterial perfusion of AE patient- derived hPBMCs secretome in the isolated guinea pig brain preparation promoted seizure-like events and induced microglial and astrocytes activation. Perfusions of healthy volunteers-derived hPBMC secretome failed to induce any changes in brain excitability and inflammatory patterns. Multiplex immunoassay revealed higher levels of all the considered and detectable inflammatory mediators in sera of the AE patients compare to healthy subjects. In particular, a significant increase in IL10, IL1RA, IL15, TNFCCL4, CXCL10 was recorded.A different cytokines pattern was recorded when PBMCs-derived supernatants collected after 6 hours in colture were analyzed. Interestingly, patients-derived PBMCs supernatants showed higher levels of IL10, CXCL10, IL6 and TNFcompared to healthy subject-derived ones, with a significance in IL10 and IL6 concentration. PBMCs and their secreted molecules seem to have an impact on brain excitability. The present findings are preliminary to further in vitro studies on the pathogenic role of PBMC-mediated inflammation on ictogenesis. Our experiments might shed light on identifying key mediators involved in seizure generation in order to identify novel treatments in epilepsies due to inflammatory and dysimmune causes.

Le crisi epilettiche si verificano frequentemente nell'encefalite autoimmune (AE), ma i fattori alla base del loro sviluppo non sono stati completamente identificati. Gli auto-Ab, infatti, possono spiegare la disfunzione sinaptica, ma solo in modo lacunoso la generazione di crisi epilettiche che non si verificano sempre e invariabilmente in tutti i pazienti affetti da AE che condividono lo stesso auto-Ab, e possono verificarsi anche in casi AE-seronegativi. Abbiamo studiato il ruolo specifico delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) derivate da pazienti affetti da AE nell'innescare l'infiammazione cerebrale e la comparsa di seizure like event (SLE). Abbiamo utilizzato una preparazione in vitro di cervello di cavia (de Curtis, 2016; PMID: 25843067) per valutare gli effetti della co-perfusione di sieroalbumina ricombinante umana con mediatori immuno-infiammatori derivati da AE (secretoma dei PBMC) sull'insorgenza di crisi epilettiche e sull'infiammazione cerebrale. Sono stati raccolti campioni di sangue da volontari sani e da pazienti affetti da AE con crisi epilettiche. I PBMC sono stati coltivati in un terreno standard per 6 ore e poi perfusi nel preparato cerebrale isolato attraverso un sistema arterioso. I sieri dei soggetti sani e dei pazienti affetti da AE e i surnatanti dei PBMC a t0 e a t6 sono stati analizzati con il sistema Multiplex Array per la rilevazione dei mediatori infiammatori. Sono state eseguite anche analisi morfologiche delle cellule gliali positive a GFAP e Iba1. La perfusione arteriosa del secretoma di hPBMCs derivati da AE paziente nella preparazione cerebrale isolata della cavia ha promosso eventi convulsivi e indotto l'attivazione microgliale e astrociti. Le perfusioni di volontari sani-derivato secretome hPBMC non hanno induciato alcun cambiamento in eccitabilità cerebrale e modelli infiammatori. Il test immunologico multiplo ha rivelato livelli più elevati di tutti i mediatori infiammatori considerati e rilevabili nei sieri dei pazienti con AE rispetto ai soggetti sani. In particolare, è stato registrato un aumento significativo di IL10, IL1RA, IL15, TNF CCL4, CXCL10. Un diverso modello di citochine è stato registrato quando i soprannumenti derivati da PBMCs raccolti dopo 6 ore in colture sono stati analizzati. Curiosamente, i soprannumpirati di PBMC derivati dai pazienti hanno mostrato livelli più elevati di IL10, CXCL10, IL6 e TNF rispetto a quelli derivati da soggetti sani, con una significatività nella concentrazione di IL10 e IL6. I PBMC e le loro molecole secrete sembrano avere un impatto sul l'eccitabilità del cervello. Le presenti conclusioni sono preliminari ad ulteriori studi in vitro sul ruolo patogeno del l'infiammazione mediata da PBMC sul l'ittogenesi. I nostri esperimenti potrebbero far luce sull'identificazione dei mediatori chiave coinvolti nella generazione di crisi epilettiche al fine di identificare nuovi trattamenti nelle epilessie dovute a cause infiammatorie e disimmuni.