Regolazione Mediata dalla Temperatura dell'Espressione di SwrA in Bacillus subtilis: Studio del Coinvolgimento dei Termometri a RNA

This thesis investigates the temperature-mediated regulation of SwrA in Bacillus subtilis and its subsequent effect on the pgs operon, which governs gamma-polyglutamic acid (γ-PGA) production. A particular focus is given to the potential role of an RNA thermometer within the untranslated region of swrA, hypothesized to function by regulating SwrA expression in response to temperature fluctuations. Based on predictions from previous studies in our laboratory, specific hairpin structures in the swrA transcript may sequester the ribosome binding site (RBS), thereby inhibiting translation at lower temperatures. However, at temperatures exceeding 37°C, it is suggested that these hairpins destabilize, exposing the RBS and allowing translation to proceed. To experimentally validate this hypothesis, we adopted a systematic approach to construct four distinct plasmids designed to analyze regulatory mechanisms underlying swrA expression. The first plasmid, pJM114 SwrA TOT, retains the wild-type chromosomal context to serve as a baseline for comparison. The second plasmid, pJM114 SwrA TOT RBS mut, incorporates a targeted mutation within the region that basepairs with the RBS, which is predicted to disrupt the hypothesized hairpin structure and eliminate its temperature-dependent regulation. These plasmids aim to highlight any direct effects of the RNA thermometer on SwrA production and were designed to integrate into multiple B. subtilis strains. Two additional plasmids were developed featuring a reporter system to allow real-time monitoring of swrA promoter activity through fluorescence. Plasmid pSSC1 places the wild-type swrA promoter upstream of the red fluorescent protein (RFP, mCherry) gene, while plasmid pSSC2 carries the same configuration but with the specific RBS region mutation. These constructs enable the visualization of swrA promoter activity, allowing for quantitative analysis under varying thermal conditions. Each plasmid should have been inserted into four distinct B. subtilis strains, two laboratory strains and two wild strains. For each strain type, one maintains the endogenous chromosomal context of the pgs operon, while the other includes a green fluorescent protein (GFP) reporter system where GFP expression is controlled by the pgs promoter, allowing direct observation of promoter activation under experimental conditions. All strains express SwrA and contain the degS200Hy mutation, which enhances DegU⁓P accumulation and allows expession of the pgs operon. The modified strains offer a range of experimental opportunities to assess the hypothesized temperature dependence of SwrA regulation. Proposed analyses include fluorescence microscopy to observe mCherry expression at single-cell resolution, phenotypic assays to quantify temperature-induced differences in γ-PGA production, and flow cytometry for population-level quantification. Together, these approaches could clarify whether the hypothesized RNA thermometer modulates SwrA expression, thus validating the regulatory role of temperature on the pgs operon. Despite challenges encountered with plasmid integration and bacterial transformation, which limited the experimental proof, this study would have established essential groundwork for subsequent research.

Lo scopo di questo lavoro è approfondire la regolazione di SwrA mediata dalla temperatura in Bacillus subtilis e il suo effetto sull'operone pgs, responsabile della produzione di acido gamma-poliglutammico (γ-PGA). Un focus particolare è posto sul possibile ruolo di un termometro a RNA situato nella regione non tradotta (UTR) del gene swrA, ipotizzato come meccanismo per regolare l’espressione di SwrA in risposta alle variazioni di temperatura. Basandosi su predizioni bioinformatiche condotte nel nostro laboratorio, alcune strutture a forcina nel trascritto di swrA potrebbero sequestrare il sito di legame del ribosoma (RBS), inibendo così la traduzione a basse temperature. Tuttavia, a temperature superiori ai 37°C, si ipotizza che queste forcine si destabilizzino, esponendo il sito RBS e consentendo l'inizio della traduzione. Per validare sperimentalmente questa ipotesi, è stato adottato un sistema sperimentale che prevede di costruire quattro distinti plasmidi progettati per analizzare la regolazione alla base dell’espressione di swrA. Il primo plasmide, pJM114 SwrA TOT, mantiene il contesto cromosomico di tipo wild-type, fungendo da riferimento per il confronto. Il secondo plasmide, pJM114 SwrA TOT RBS mut, incorpora una mutazione nella regione che si appaia all’ RBS, che si prevede possa destabilizzare la struttura a forcina ipotizzata, eliminando la regolazione dipendente dalla temperatura. Questi plasmidi sono stati progettati per mettere in evidenza eventuali effetti diretti del termometro a RNA sulla produzione di SwrA e per integrarsi in diversi ceppi di B. subtilis. Sono stati inoltre sviluppati due plasmidi aggiuntivi con un sistema reporter per consentire il monitoraggio in tempo reale dell'attività del promotore di swrA attraverso la fluorescenza. Il plasmide pSSC1 posiziona il promotore swrA di tipo wild-type a monte del gene per la proteina fluorescente rossa (RFP, mCherry), mentre il plasmide pSSC2 possiede la stessa configurazione ma con la mutazione specifica nella regione vicina all’RBS. Questi costrutti permettono la visualizzazione dell'attività del promotore di swrA, consentendo analisi quantitative in condizioni termiche variabili. Ogni plasmide dovrebbe essere inserito in quattro distinti ceppi di B. subtilis: due ceppi di laboratorio e due ceppi di tipo selvatico. Per ogni tipo di ceppo, uno mantiene il contesto cromosomico endogeno dell'operone pgs, mentre l'altro include un sistema reporter in cui l'espressione della green fluorescent protein (GFP) è controllata dal promotore di pgs, consentendo l’osservazione diretta dell'attivazione del promotore in condizioni sperimentali. Tutti i ceppi esprimono SwrA e possiedono la mutazione degS200Hy, che aumenta l'accumulo di DegU⁓P, permettendo quindi l’attivazione dell’operone pgs. I ceppi modificati offrono diverse possibilità sperimentali per valutare l'ipotesi della dipendenza dalla temperatura nella regolazione di SwrA. Le analisi proposte includono la microscopia a fluorescenza per osservare l’espressione di mCherry a livello della singola cellula, saggi fenotipici per quantificare le differenze di produzione di γ-PGA indotte dalla temperatura, e la citometria a flusso per la quantificazione a livello di popolazione. Complessivamente, questi approcci avrebbero potuto chiarire se il termometro a RNA ipotizzato modula l’espressione di SwrA, convalidando così il ruolo regolatorio della temperatura sull’operone pgs. Nonostante le difficoltà incontrate nell'integrazione dei plasmidi e nella trasformazione batterica, che hanno impedito la riuscita dell’esperimento, questo studio avrebbe fornito una base per ricerche future.