IDENTIFICAZIONE E QUANTIFICAZIONE DELL’ACIDO γ-AMINOBUTIRRICO (GABA) MEDIANTE LC/MS IN PLASMA EQUINO

Gamma-aminobutyric acid (GABA) is the main inhibitory neurotransmitter in the central nervous system and regulates neuronal excitability. There is evidence that GABA is often used a few hours before competitions in equestrian sports to calm nervous horses. However, its administration is difficult to detect as it is an endogenous substance and is present in equine plasma at low levels, in the range of ng/mL; therefore, it is necessary to develop a sensitive method to quantify baseline GABA levels in horse plasma. This experimental thesis, carried out at the Veterinary Toxicology Laboratory of Unirelab, aims to develop a method for the identification and quantification of GABA in horse plasma. The method developed uses the dilute and shoot technique followed by High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) coupled with Triple Quadrupole Mass Spectrometry (MRM). The calibrators were prepared in an artificial surrogate matrix composed of 35 mg/mL of equine serum albumin in a phosphate-buffered saline solution. The samples were prepared by protein precipitation with acetonitrile, followed by 1:10 matrix dilution for direct injection into HPLC-MRM. Upon completion of method development, quantitative validation was performed by evaluating parameters such as selectivity, limit of quantification (LOQ), linearity, repeatability, accuracy, and measurement uncertainty. The final results obtained meet the acceptance criteria adopted: - The test method is selective for GABA; - The LOQ of the method is 10 ng/mL; - Linearity is met in the measurement range of 10-600 ng/mL; - The method is: • Repeatable with CV < 15% • Reproducible with CV < 25% • Accurate with BIAS < 15% - The measurement uncertainty calculated at 50 ng/mL of GABA in equine plasma is 19%. Using this methodology, a total of 600 equine plasma samples were quantified, collected both pre-race and post-race from horses participating in equestrian competitions in Italy. A statistical analysis of the collected data allowed for the evaluation of the population distribution and the establishment of the average concentration value of GABA in equine plasma.

L'acido γ-aminobutirrico (GABA) è il principale neurotrasmettitore inibitorio del sistema nervoso centrale e regola l'eccitabilità neuronale. Ci sono evidenze che il GABA sia spesso utilizzato poche ore prima delle competizioni negli sport equestri per calmare cavalli nervosi. Nonostante ciò, la sua somministrazione è difficile da identificare poiché è una sostanza endogena ed è presente nel plasma equino a bassi livelli, nell'ordine di ng/mL; pertanto, è necessario sviluppare un metodo sensibile per quantificare i livelli basali del GABA nel plasma di cavallo. La presente tesi sperimentale, svolta presso il Laboratorio di Tossicologia Veterinaria di Unirelab, si propone la messa a punto di un metodo per l’identificazione e la quantificazione della sostanza GABA nel plasma di cavallo. Il metodo sviluppato sfrutta la tecnica del dilute and shoot seguita dall’analisi Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione (HPLC) accoppiata alla Spettrometria di Massa con Triplo quadrupolo (MRM). I calibratori sono stati preparati in una matrice surrogata artificiale composta da 35 mg/mL di albumina sierica equina in soluzione salina tamponata con fosfato. I campioni sono stati preparati mediante precipitazione proteica con acetonitrile e successiva diluizione 1:10 della matrice per l’iniezione diretta in HPLC-MRM. Ultimato lo sviluppo del metodo, è stata eseguita la validazione quantitativa attraverso la valutazione di parametri quali selettività, limite di quantificazione (LOQ), linearità, ripetibilità, accuratezza e incertezza di misura. I risultati finali ottenuti soddisfano i criteri d’accettazione adottati: - Il metodo di prova è selettivo per il GABA; - Il LOQ del metodo è pari a 10 ng/mL - La linearità è soddisfatta nel campo di misura 10-600 ng/mL - Il metodo risulta: • ripetibile per CV < 15% • riproducibile per CV < 25% • accurato con BIAS < 15% - L’incertezza di misura calcolata a 50 ng/ml di GABA nel plasma equino è pari al 19% Utilizzando questa metodologia, sono stati quantificati in totale 600 campioni di plasma equino raccolti pre-corsa e post-corsa provenienti dai cavalli partecipanti alle competizioni equestri in Italia. Un’analisi statistica sui dati raccolti ha permesso di valutare la distribuzione della popolazione e stabilire il valore medio della concentrazione del GABA nel plasma equino.