Combinazione delle tecniche SEC, NMR e LC-MS per lo studio delle peculiarità strutturali del pentosano polisolfato, principio attivo dell’Elmiron®.

Il Pentosano Polisolfato Sodico (PPS) è il principio attivo dell’Elmiron® e del Fibrase®, farmaci approvati da FDA, EMA e AIFA, rispettivamente per il trattamento della cistite interstiziale e come antitrombotico. Il PPS è un polisaccaride solfatato semisintetico, con peso molecolare medio di circa 6kDa, ottenuto mediante processo di solfatazione del 4-O-metilglucuronoxilano. È costituito principalmente da catene lineari di unità di β (1-4) xilosio 2,3-O-disolfatato con ramificazioni di acido α (1-2) 4-O-metilglucuronico 2,3-O-disolfatato (MGA). Grazie alla sua struttura, simile a quella eparinica, il PPS suscita un crescente interesse per le sue potenziali attività biologiche (anticoagulante, antivirale, antitumorale, ecc.). Gli studi per nuove applicazioni terapeutiche e le stringenti richieste degli enti regolatori per lo sviluppo di versioni equivalenti del PPS richiedono una caratterizzazione sempre più dettagliata delle peculiarità strutturali di questo polisaccaride. La sua elevata eterogeneità richiede l’impiego di più tecniche analitiche, non solo per caratterizzare le sequenze principali, ma anche per definire le peculiarità strutturali dovute al processo industriale e allo xilano, la materia prima da cui viene prodotto il PPS. L’obiettivo principale del progetto di tesi è la caratterizzazione della struttura, ancora non descritta in dettaglio, costituita dall’aldeide generata sul residuo dello xilosio in posizione riducente, che rappresenta uno dei critical quality attributes (CQAs) del PPS. La prima parte del lavoro è stata dedicata all’ottimizzazione del frazionamento tramite Size Esclusion Chrmatography (SEC) di una frazione del PPS ottenuta mediante cromatografia a scambio ionico. Questo frazionamento multi-step ha permesso di isolare e caratterizzare via NMR e LC-MS dieci sotto-frazioni. Le sotto-frazioni tetra- e pentasaccaridiche sono risultate particolarmente arricchite dei residui con l’aldeide. La dettagliata attribuzione degli spettri NMR mono e bidimensionali ha permesso lo studio dell’anello riducente 2,3-insaturo con l’aldeide in C1. Poichè le aldeidi α,β-insature sono specie reattive, potrebbero avere effetti tossici nell’organismo. L’identificazione e quantificazione di residui che le contengono è quindi particolarmente rilevante per garantire la sicurezza del PPS. Questo approccio sperimentale ha permesso inoltre di isolare e caratterizzare sotto-frazioni contenenti catene MGA-ramificate e prive di strutture lineari con una lunghezza di almeno nove residui, descritte nella seconda parte della tesi. Si ipotizza che l’acido metilglucuronico, originariamente presente nello xilano, possa influenzare le interazioni PPS-target. Le frazioni isolate potrebbero quindi essere utilizzate come modelli per gli studi di binding con varie proteine. In questo studio la loro capacità di interazione con il Fattore Piastrinico 4 (PF4) è stata confrontata con un decasaccaride lineare, isolato sempre nell’ambito di questo progetto. Ciò ha consentito di valutare l’influenza della ramificazione sulla possibile insorgenza della trombocitopenia, una complicanza nel trattamento con eparinoidi. In conclusione, questo studio oltre ad aggiungere informazioni strutturali importanti per la caratterizzazione del PPS e per il confronto con farmaci generici, ha consentito di isolare e caratterizzare componenti oligosaccaridiche che saranno utilizzate per studi conformazionali e di binding con proteine target.