Il ruolo della genetica molecolare nella diagnosi della sclerosi laterale amiotrofica

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by the progressive degeneration of upper and lower motor neurons. Sporadic ALS patients (sALS), such as patients with no family history, account for 10% of ALS cases. The SOD1 gene was the first to be linked to ALS in 1993, while the C9orf72 gene, discovered in 2011, nowadays represents the major genetic contributor to ALS. In recent years, the development of next-generation sequencing (NGS) technologies has led to the identification of over 40 genes associated with ALS, improving our understanding of the genetic basis of this disease. Moreover, very recently, new gene therapy has arisen for ALS patients, especially for SOD1-positive patients. Thus, reaching a genetic diagnosis may become crucial for the clinical outcome of these patients. Here we investigated the genetic contribution to ALS pathogenesis in a cohort of 386 patients from the IRCCS Mondino of Pavia between 2020 and 2024 in a three-step diagnostic approach: the screening of the SOD1 gene was performed as a first-tier test through Sanger sequencing, followed by the analysis of the (G4C2)n hexanucleotide repeat expansion in the C9orf72 gene using a three-primer PCR technique; lastly, in negative patients, whole exome sequencing (WES) was performed and an in silico panel of 57 genes known to be associated with ALS was investigated to identify any potential pathogenic or likely pathogenic variants. Sanger sequencing of the SOD1 gene allowed the identification of pathogenic or likely pathogenic variants in 4 patients (1.03%) in a rapid manner, that means in about two weeks. The rapidity was crucial for SOD1-positive patients in order to access the innovative antisense oligonucleotides (ASOs) gene therapy, that has been currently approved for patients carrying SOD1 mutations. Indeed, the earlier the diagnosis the better the response to the therapy and the slower the clinical course. Through microsatellite analysis, a pathological hexanucleotide repeat expansion in the C9orf72 gene was detected in 23 cases (6.38%), confirming the C9orf72 gene as the major genetic contributor to ALS pathogenesis. In patients who tested negative for SOD1 and C9orf72 analysis, WES allowed us to identify pathogenic or likely pathogenic variants in 6 more patients, leading to a genetic diagnosis in another 1.11% of cases. Eventually, 9 patients resulted to be carriers of variants of uncertain significance (VUS) in ALS genes, leading to an inconclusive diagnosis. Overall, using this approach based on different techniques, a definitive genetic diagnosis was obtained in 33/386 patients (8.54%), in line with the expected genetic contribution in sALS patients. The results of this study highlight the importance of genetics in ALS pathogenesis and suggest the screening of SOD1 and C9orf72 as a first-tier test, followed by WES in routine diagnostic investigations of sALS cases.

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa fatale, caratterizzata dalla progressiva degenerazione dei motoneuroni superiori e inferiori. I pazienti con SLA sporadica (sALS), cioè senza una storia familiare della malattia, rappresentano circa il 90% dei casi di SLA. Il gene SOD1 è stato il primo ad essere associato alla SLA nel 1993, mentre il gene C9orf72, scoperto nel 2011, rappresenta attualmente il principale contributo genetico alla patogenesi della malattia. Negli ultimi anni, lo sviluppo delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha portato all’identificazione di oltre 40 geni associati alla SLA, migliorando la comprensione delle basi genetiche della patologia. Inoltre, molto recentemente, sono emerse nuove terapie geniche per i pazienti affetti da SLA, in particolare per coloro che presentano mutazioni nel gene SOD1. Di conseguenza, ottenere una diagnosi genetica può rivelarsi cruciale per l’esito clinico di questi pazienti. In questo studio abbiamo investigato il contributo genetico alla patogenesi della SLA in una coorte di 386 pazienti afferenti all’IRCCS Mondino di Pavia tra il 2020 e il 2024, attraverso un approccio diagnostico in tre fasi: lo screening del gene SOD1 è stato eseguito come test di primo livello mediante sequenziamento Sanger; successivamente è stata condotta l’analisi dell’espansione esanucleotidica (G4C2)n nel gene C9orf72 tramite una tecnica PCR a tre primer; infine, nei pazienti negativi, è stato effettuato il sequenziamento dell’esoma (WES), e attraverso un pannello in silico sono stati analizzati 57 geni noti per la loro associazione alla SLA, al fine di identificare eventuali varianti patogenetiche o probabilmente patogenetiche. Il sequenziamento Sanger del gene SOD1 ha permesso di identificare varianti patogenetiche o probabilmente patogenetiche in 4 pazienti (1,03%) in tempi rapidi, ovvero circa due settimane. Questa tempestività è risultata fondamentale per consentire ai pazienti positivi a SOD1 di accedere alla terapia genica innovativa con oligonucleotidi antisenso (ASO), attualmente approvata per i portatori di mutazioni in SOD1. Infatti, quanto più precoce è la diagnosi, tanto maggiore è l’efficacia della terapia e più lento risulta il decorso clinico. Attraverso l’analisi dei microsatelliti, è stata rilevata un’espansione esanucleotidica patologica nel gene C9orf72 in 23 casi (6,38%), confermando C9orf72 come il principale gene associato alla patogenesi della SLA. Nei pazienti risultati negativi all’analisi di SOD1 e C9orf72, il WES ha permesso di identificare varianti patogenetiche o probabilmente patogenetiche in ulteriori 6 pazienti, portando a una diagnosi genetica in un ulteriore 1,11% dei casi. Infine, 9 pazienti sono risultati portatori di varianti a significato incerto (VUS) in geni associati alla SLA, determinando una diagnosi non definitiva. Nel complesso, utilizzando questo approccio basato su metodiche differenti, è stata ottenuta una diagnosi genetica definitiva in 33 pazienti su 386 (8,54%), in linea con quanto atteso per i casi di SLA sporadica. I risultati di questo studio sottolineano l’importanza della genetica nella patogenesi della SLA e suggeriscono l’inclusione di SOD1 e C9orf72 come test di primo livello, seguiti da WES, nell’iter diagnostico dei casi di sALS.